朱 冰 管佳佳 傅 軍 駱 杰 （蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，蚌埠 233000）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率位居世界第三，約為10%，嚴(yán)重威脅人類生命健康［1］。胃癌細胞的惡性增殖是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，但胃癌早期癥狀不明顯，診斷時已進入進展期。胃癌發(fā)病機制尚未明確，目前認為是遺傳、環(huán)境及幽門螺桿菌共同作用的結(jié)果。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程依賴于血管的生成，新生的血管促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在血管生成過程中，需要多種細胞因子共同調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以與其受體 VEGF 受體-2 結(jié)合，促進血管新生，從而抑制VEGF 表達，可能是抗腫瘤血管生成的重要策略［2-3］?，F(xiàn)已證實生長因子及其所攜帶的刺激信號通過JAK2/STAT3 信號通路傳入細胞核，使血管內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖、分化和凋亡，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-5］。JAK2/STAT3 信號通路作用非常廣泛，在調(diào)控氧化應(yīng)激、細胞自噬、炎癥反應(yīng)及腫瘤等方面均發(fā)揮重要作用。目前JAK2/STAT3 信號通路通過調(diào)控細胞自噬水平在心肌缺血再灌注損傷、惡性黑素瘤、肺癌以及大腸癌等方面起保護作用，但在胃癌方面的作用鮮有報道［6-9］。

本研究旨在通過JAK2/STAT3 信號通路調(diào)控細胞自噬水平，觀察對胃癌血管生成的影響機制，為今后臨床治療胃癌提供理論和實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2019 年1 月至12 月期間80 例胃癌患者的病歷資料及手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本（含對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，距腫瘤邊緣≥5 cm）。采集的標(biāo)本保存于液氮。一般臨床資料包括患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤直徑、腫瘤位置、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度等臨床信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胃鏡和病理檢查診斷為胃癌；②無重大疾病或傳染病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①癌旁組織有明顯的炎癥細胞浸潤；②胃潰瘍、胃糜爛者；③其他惡性腫瘤者；④妊娠或哺乳女性。另外選取30例胃鏡及病理檢查健康者為對照組。所有患者均簽署知情同意書，本研究已獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑 人胃癌細胞株BGC-823（中國科學(xué)院細胞資源庫）；靶向JAK2 的miR-375（5'-TGAGACATTAAAGTGAACCGGA-3'）、mimic NC（上海吉碼制藥技術(shù)有限公司）；JAK2、STAT3 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人p-JAK2、p-STAT3、LC3、Beclin1、VEGF 單克隆抗體（美國Cell Signal Technology 公司）；Trizol RNA 提取試劑盒、LipofectamineTM3000 脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物技術(shù)有限公司）；免疫組化S-P 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白測定試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；DYCZ 425D 型雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；IX51倒置顯微鏡（日本Olimpus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組 將BGC-823 細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合達到80%時胰酶消化傳代。以1×105個/孔的密度將細胞接種于6 孔板，采用LipofectamineTM3000 將靶向JAK2 的miR-375 和mimic NC 轉(zhuǎn)染細胞并常規(guī)培養(yǎng)。細胞分為3 組：空白對照組（control 組）；轉(zhuǎn)染mimic NC 的陰性對照組（si-mimic-NC 組）、轉(zhuǎn)染miR-375的干擾組（si-JAK2組）。

1.2.2 在線生物數(shù)據(jù)庫分析 使用Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫（https：//www. proteinatlas. org/）在線分析JAK2、STAT3在人體各組織和器官中的表達情況以及在正常胃組織和胃癌組織中的表達水平，使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia. cancer-pku. cn/）分析JAK2、STAT3表達水平對患者預(yù)后生存期的影響。

1.2.3 免疫組化檢測胃癌患者p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平 取患者凍存的組織，經(jīng)固定、包埋等步驟制作成3 μm 石蠟切片。經(jīng)60 ℃熔蠟、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、高壓抗原修復(fù)后，分別滴加一抗p-JAK2（1∶200）、p-STAT3（1∶200）孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）孵育20 min，DAB 顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水、透明、封片，鏡檢（×200）。染色結(jié)果判定：隨機選取5個視野，根據(jù)染色面積及強度進行評分。染色面積：0 分為＜5%，1分為5%~25%，2分為26%~50%，3分為51%~100%。染色強度：未染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。染色總分=染色面積×染色強度，總分≥3分為高表達，＜3分為低表達。

1.2.4 qRT-PCR檢測各組細胞JAK2、STAT3 mRNA表達水平 取凍存的胃癌組織，采用Trizol 法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進行擴增，GAPDH 為內(nèi)參。2-ΔΔCt計算 JAK2、STAT3的相對表達水平。JAK2正向引物：5'-TCTGTGGGAGATCTGCAGTG-3'，反向引物：5'-TTTCAGAGCTGTCATCCGTG-3'，STAT3 正向引物：5'-GACCCGCCAACAAATTAAG-3'，反向引物：5'-TGGTGTCCAGTTTACCACGA-3'。

1.2.5 Western blot檢測各組細胞p-JAK2、p-STAT3、LC3、Beclin1、VEGF 蛋白表達水平 取凍存的胃癌組織，加入RIPA裂解液，超聲勻漿提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂牛奶TBST 封閉2 h，加入一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，用ECL 化學(xué)發(fā)光劑進行顯影，以GAPDH 為內(nèi)參校正，Image J 軟件進行發(fā)光結(jié)果的灰度分析。

1.2.6 透射電鏡觀察各組細胞自噬泡的形成 細胞轉(zhuǎn)染 24 h 后，胰酶消化，以 1×106個/孔接種在 6 孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細胞，用4%戊二醛于4 ℃固定，然后進行常規(guī)電鏡的固定、脫水、包埋，制成超薄切片，H-7500 透射電鏡下觀察各組細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.7 Matrigel體外成管實驗檢測細胞的血管生成能力 取50 μl/孔新鮮配制的Matrigel 基質(zhì)膠加入96 孔培養(yǎng)板，待 Matrigel 膠凝固，以 1×104個/ml 的密度將各組BGC-823 細胞接種于96 孔板培養(yǎng)48 h，每孔設(shè)3 個復(fù)孔，倒置顯微鏡（×100）下觀察細胞血管生成情況并記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS16.0 軟件，作圖工具采用Graphpad 5.0，計數(shù)資料采用n（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在線生物數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫（圖1、圖2）顯示，JAK2、STAT3 廣泛存在于肺、膽囊、淋巴、扁桃體、胃等組織和器官中，與正常組織相比，胃癌組織中JAK2、STAT3 表達明顯升高。GEPIA 數(shù)據(jù)庫顯示，胃癌組織的JAK2、STAT3 表達水平也明顯高于正常組織（圖3A、圖4A），且JAK2、STAT3 的表達量越高，患者生存期越短（圖3B、圖4B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明JAK2、STAT3的表達在胃癌中具有研究意義。

圖1 人體中以及正常胃組織和胃癌組織中JAK2表達Fig.1 Expressions of JAK2 in humans，normal gastric tissues and gastric cancer tissues

圖2 人體及正常胃組織和胃癌組織中STAT3表達Fig.2 Expression of STAT3 in humans，normal gastric tissues and gastric cancer tissues

圖3 胃癌組織中JAK2表達及其對預(yù)后的影響Fig.3 JAK2 expression in gastric cancer tissues and its effect on prognosis

圖4 胃癌組織中STAT3表達及其對預(yù)后的影響Fig.4 STAT3 expression in gastric cancer tissues and its effect on prognosis

2.2 免疫組化染色檢測p-JAK2、p-STAT3的表達免疫組化染色結(jié)果顯示（圖5），p-JAK2、p-STAT3 在腫瘤細胞中陽性表達，呈灶狀和彌漫狀分布。其陽性表達率顯著高于癌旁組織和正常組織。

圖5 p-JAK2、p-STAT3在患者正常胃組織、胃癌組織及癌旁組織中的表達（×200）Fig.5 Expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in normal gastric tissue，gastric cancer tissue and adjacent tissues of patients（×200）

2.3 p-JAK2、p-STAT3的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 如表1 所示，為驗證p-JAK2、p-STAT3 在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，將80 例患者按p-JAK2、p-STAT3 相對表達量分為高表達組（p-JAK2：48 例；p-STAT3：52例）、低表達組（p-JAK2：32例；p-STAT3：28 例）。結(jié)果顯示，p-JAK2、p-STAT3 的表達水平與年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤位置等無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度有明顯的相關(guān)性（P＜0.05）。p-JAK2、p-STAT3 表達越高，腫瘤越大，浸潤深度越嚴(yán)重，分化程度越低，淋巴結(jié)越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

表1 胃癌組織中p-JAK2、p-STAT3表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析［例（%）］Tab.1 Analysis of relationship between expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 in gastric cancer tissues and clinical pathological parameters of patients［n（%）］

2.4 qRT-PCR檢測細胞JAK2、STAT3 mRNA表達qRT-PCR結(jié)果顯示（圖6），與control組和si-mimic-NC組相比，si-JAK2 組的 JAK2、STAT3 表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而control 組和si-mimic-NC組JAK2、STAT3表達水平無顯著性變化（P＞0.05）。

圖6 JAK2、STAT3 mRNA在各組細胞中的表達Fig.6 JAK2，STAT3 mRNA expressions in each group of cells

2.5 Western blot 檢測細胞 p-JAK2、p-STAT3、LC3、Beclin1、VEGF的表達 Western blot結(jié)果顯示（圖7），與 control 組和 si-mimic-NC 組相比，si-JAK2 組細胞中 p-JAK2、p-STAT3、VEGF 表達水平明顯下降，LC3、Beclin1表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計意義（P＜0.05），而control組和si-mimic-NC組細胞各蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 Western blot 檢測 p-JAK2、p-STAT3、LC3、Beclin1、VEGF蛋白表達水平Fig.7 Western blot detection of p-JAK2，p-STAT3，LC3，Beclin1 and VEGF protein expression levels

2.6 透射電鏡觀察各組細胞自噬泡的形成 透射電鏡結(jié)果顯示（圖 8），control 組和 si-mimic-NC 組細胞內(nèi)細胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，細胞質(zhì)內(nèi)幾乎未見自噬體或自噬泡形成；而si-JAK2 組出現(xiàn)自噬體，內(nèi)含降解成分。

圖8 透射電鏡觀察各組細胞自噬泡形成（×10 000）Fig.8 Transmission electron microscope observation of formation of autophagic vesicles in each group（×10 000）

2.7 Matrigel 體外成管實驗檢測細胞的血管生成能力 小管形成實驗結(jié)果顯示（圖9），與control 組和si-mimic-NC 組相比，si-JAK2 組細胞小管生成數(shù)量明顯下降（P＜0.05），而control組和si-mimic-NC組細胞小管形成數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖9 Matrigel體外成管實驗檢測細胞的血管生成能力Fig.9 Matrigel in vitro tube formation experiment to detect angiogenesis ability of cells

3 討論

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位列第四，致死率位列第二［10］。盡管外科手術(shù)、化療、放療等治療手段快速發(fā)展，但由于胃癌缺乏特異性癥狀易錯過最佳治療時間和癌細胞的轉(zhuǎn)移性等，使得胃癌患者五年生存率不到30%［11］。因此對胃癌的早期檢測和治療至關(guān)重要。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌細胞及其微環(huán)境相互作用的結(jié)果，而細胞自噬和血管生成是適應(yīng)微環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)［12］。在此過程中JAK2/STAT3 信號通路參與其中，JAK2/STAT3信號通路在調(diào)控氧化應(yīng)激、細胞自噬、炎癥反應(yīng)及腫瘤等方面均發(fā)揮重要作用。岳彩飛等[13]發(fā)現(xiàn)褪黑素可抑制PDGF 誘導(dǎo)的HSC-T6 的活化與增殖,其機制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)。齊麗娜等［14］發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3 信號通路影響豬卵巢黃體的形成與退化。王丹丹［15］發(fā)現(xiàn)柔紅霉素通過JAK2/STAT3 信號通路影響細胞自噬途徑誘導(dǎo)心肌細胞肥大。本研究將靶向JAK2 的miR-375 轉(zhuǎn)染至BGC-823細胞，通過阻斷JAK2/STAT3信號通路觀察對胃癌細胞自噬水平及血管生成的影響。

JAK2 是一種非受體型酪氨酸激酶，活化的JAK2能夠誘導(dǎo)反向STAT3的磷酸化，游離的p-STAT3形成二聚體并進入細胞核，進而調(diào)控反向靶基因的表達［16］。在惡性腫瘤中，持續(xù)的生長信號導(dǎo)致STAT3 處于持續(xù)活化狀態(tài)。本研究顯示胃癌組織p-JAK2、p-STAT3 的表達水平明顯高于癌旁組織和正常胃組織，p-JAK2、p-STAT3表達越高，腫瘤越大，浸潤深度越嚴(yán)重，分化程度越低，淋巴結(jié)越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)轉(zhuǎn)染BGC-823 細胞后，與control 組和si-mimic NC組相比，si-JAK2組細胞p-JAK2、p-STAT3表達明顯降低。同時Human Protein Atlas 和GEPIA在線數(shù)據(jù)庫也顯示胃癌組織JAK2、STAT3的表達水平高于正常組織，且JAK2、STAT3表達越高，預(yù)后生存期越短（P＜0.05）。提示JAK2/STAT3 信號通路在胃癌中發(fā)揮促癌作用。與朱秀敏［17］發(fā)現(xiàn)SIRT6通過抑制JAK2/STAT3 信號通路抑制胃癌生長結(jié)果一致。

細胞自噬是生物體內(nèi)高度保守的代謝途徑，能夠吞噬細胞內(nèi)受損、衰老以及失去功能的蛋白質(zhì)，形成自噬泡被溶酶體水解。自噬過程需要多個自噬調(diào)節(jié)蛋白參與。Beclin-1 基因（也稱BECN1 基因），與自噬相關(guān)基因ATG6/vps30同源，可以誘導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡上，是誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵基因，可抑制腫瘤的形成與生長。王穎［18］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Beclin-1 表達量明顯低于癌旁組織，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達量低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者。武冰潔等［19］發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中Beclin-1 陽性表達率低于非胃癌組織，Ⅲ、Ⅳ期的表達率低于Ⅰ、Ⅱ期。本研究發(fā)現(xiàn)與control 組和si-mimic NC 組相比，si-JAK2 組細胞Beclin-1 表達明顯升高。提示Beclin-1 低表達與胃癌關(guān)系密切，且對胃癌的進展起調(diào)控作用。LC3 是自噬體膜蛋白，可作為檢測自噬活動的標(biāo)志物，沒有自噬發(fā)生時，以LC3-Ⅰ形式存在，當(dāng)發(fā)生自噬后，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3-Ⅱ，從而啟動自噬。因此常用LC3 或LC3-Ⅱ水平檢測自噬情況。宋華勇等［20］和羅小月等［21］研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中LC3 陽性表達率明顯低于癌旁組織，且與胃癌發(fā)展程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與control組和 si-mimic NC 組相比，si-JAK2 組細胞 LC3 表達明顯升高，提示LC3 與胃癌發(fā)展程度相關(guān)。本研究透射電鏡觀察到control 組和si-mimic-NC 組細胞內(nèi)幾乎未見自噬體或自噬泡形成；而si-JAK2 組細胞出現(xiàn)自噬體。提示JAK2/STAT3 信號通路的阻斷促進了細胞自噬水平。

腫瘤的生長和發(fā)展伴隨著大量微血管的生成，新生血管不僅為腫瘤細胞輸送營養(yǎng)、排泄代謝廢物，而且還能促進其轉(zhuǎn)移。VEGF 能夠促進腫瘤微血管形成，是促進血管生長因子里面作用最強的，當(dāng)與VEGFR1 和VEGFR2 受體結(jié)合后，能使血管迅速生長。本研究發(fā)現(xiàn)與control 組和si-mimic NC 組相比，si-JAK2 組細胞VEGF 表達、小管生成數(shù)量明顯下降，與董峰等［22］研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究探討JAK2、STAT3 在胃癌中的表達及臨床意義，證實了JAK2、STAT3 在胃癌中高表達且發(fā)揮促癌作用，并且與胃癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，其可能是JAK2/STAT3 信號通路抑制了細胞自噬且增加了血管形成能力，對胃癌患者的預(yù)后具有指導(dǎo)意義。