王 嬌 張 莉 李 穎 王 慧 王 湛 劉宏圖

（中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

p62（sequestosome-1，SQSTM1）是一種重要的自噬銜接蛋白，越來越多證據(jù)表明p62 在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并充當(dāng)泛素化底物的自噬受體。p62 蛋白含有多個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域，包括泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白作用區(qū)（KIR）、微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3作用域（LIR）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Phox 和Bem1p（PB1）結(jié)構(gòu)域和ZZ 型鋅指區(qū)（ZZ）等6 個(gè)功能區(qū)域［1-3］。p62 蛋白異常表達(dá)與神經(jīng)退行性病變（如亨廷頓病、阿爾茨海默病、帕金森?。⒛[瘤、感染性疾病、遺傳性疾病以及慢性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。

p62 蛋白可結(jié)合多種配體，并作為多種信號傳導(dǎo)級聯(lián)的信號傳導(dǎo)中樞，如Keap1-Nrf2、m-TOR 和NF-κB信號通路［6］。其中，Keap1-Nrf2通路是抗氧化和親電應(yīng)激的主要細(xì)胞防御機(jī)制之一［7-8］。正常情況下，Keap1 同源二聚體通過雙位點(diǎn)結(jié)合識別Nrf2單體，Nrf2 被泛素-蛋白酶體降解［9］。暴露于氧化應(yīng)激或親電損傷后，Keap1 被氧化劑修飾，導(dǎo)致構(gòu)象變化。Nrf2 從Keap1 相互作用中逃逸并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以誘導(dǎo)一系列編碼抗氧化劑和抗炎酶的Nrf2 靶基因［10］。 磷 酸 化 的 p62 通 過 Keap1 相 互 作 用區(qū) 域（Keap1 interaction region，KIR）結(jié)構(gòu)域與Nrf2競爭性結(jié)合 Keap1，使 Nrf2 從 Keap1 上解離，累積于細(xì)胞中［11］。 另 外 ，JENA 等［12-13］研 究 顯 示 ，p62 可 與TRIM16、Nrf2 形成復(fù)合物，對錯(cuò)誤折疊蛋白轉(zhuǎn)化為蛋白聚集體起重要作用，有利于腫瘤生長。因此，本研究試圖通過免疫共沉淀和質(zhì)譜法探究p62 和Nrf2 的相互作用，尋找p62 作為自噬相關(guān)蛋白在Keap1-Nrf2通路與自噬間的新功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；真核表達(dá)質(zhì)粒載體nFLAG/pRK5 和HEK293T 細(xì)胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腫瘤相關(guān)病毒室保存。

1.1.2 試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶BglⅡ、SalⅠ和DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 NEB 公司；Ex Taq 酶、dNTPs Mix 和10×PCR Buffer 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；T4 DNA 連接酶、DNA 片段純化試劑盒、DNA 凝膠電泳回收試劑盒和DNA 連接試劑盒購自德國QIAGEN 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript Ⅲ試劑盒購自Invitrogen 公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；氨芐青霉素（Amp）購自Invitrogen 公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉和瓊脂糖購自AMERESCO 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；p62 抗體（5114S）購自美國 CST 公司；Nrf2抗體（ab62352）、山羊抗鼠二抗（ab6789）和山羊抗兔二抗（ab205718）購自美國Abcam 公司；小鼠抗FLAG-tag 單克隆抗體（F1804）和β-actin（A2228）購自美國Sigma公司；銀染試劑購自美國Bio-Rad公司；引物合成由上海生工（生物）工程有限公司完成，質(zhì)粒測序和蛋白質(zhì)譜檢測由北京華大基因完成；Western blot 成像采用 ChemiScope 6200 Touch 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中SQSTM1 基因序列（Variant 2，NM_001142298），采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，SQSTM1正向引物序列：5'-TCGAAGATCTATGGCGTCGCTCACCG-3'（下劃線部分為BglⅡ酶切位點(diǎn)），SQSTM1反向引物：5'-GATCGTCGACATTCAACGGCGGGGGATGCT-3'（下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為1 100 bp。引物由上海生工（生物）工程有限公司合成。

1.2.2SQSTM1（p62）基因PCR擴(kuò)增 按照QIAGEN RNeasy Mini kit 說明書從HeLa 細(xì)胞中提取總RNA，Invitrogen SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，PCR 擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系為：模板 cDNA 1 μl，正反向引物（2 μmol/L）各 2.5 μl，Ex Taq 0.25 μl，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 μl，10×PCR buffer 5 μl，加ddH2O 補(bǔ)至 50 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min→95 ℃1 min，55 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)→95 ℃ 20 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)→72 ℃ 10 min。

1.2.3 自噬相關(guān)蛋白p62 真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 真核表達(dá)質(zhì)粒載體nFLAG/pRK5 圖譜見圖1。雙酶切空載體nFLAG/pRK5 和SQSTM1基因，采用T4 連接酶將SQSTM1基因連接至 nFLAG/pRK5 真核表達(dá)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒nFLAG-SQSTM1/pRK5，BamHⅠ單酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

圖1 質(zhì)粒載體nFLAG/pRK5圖譜及酶切位點(diǎn)Fig.1 Plasmid vector map of nFLAG/pRK5 and restriction sites

1.2.4 目的基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染前將HEK293T細(xì)胞接種至6 孔板，融合率達(dá)到60%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)細(xì)胞孔中分別轉(zhuǎn)染nFLAG-SQSTM1/pRK5（FLAG-p62）質(zhì)粒和 nFLAG/pRK5 空載體質(zhì)粒 1 μg，轉(zhuǎn)染試劑為X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，轉(zhuǎn)染比為1∶3，轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物Western blot 鑒定 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。采用4%~20%SDS-PAGE 膠，取25μg樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至0.45 μm NC 膜，室溫封閉1 h，PBST漂洗3 次，5 min/次，以 p62 抗體為一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3次，10 min/次，以山羊抗鼠為二抗（1∶20 000 稀釋）孵育 1 h，PBST 洗滌3次，10 min/次，ECL顯色，發(fā)光，分析結(jié)果。

1.2.6 重組p62 蛋白功能鑒定 實(shí)驗(yàn)分為4 組：不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組、僅轉(zhuǎn)染FLAG-p62 質(zhì)粒組、僅轉(zhuǎn)染HA-Nrf2 質(zhì)粒組、共轉(zhuǎn)染 FLAG-p62 和 HA-Nrf2 質(zhì)粒組。將待轉(zhuǎn)質(zhì)粒5.0μg 加入至1 ml opti-MEM，滴加轉(zhuǎn)染試劑 15 μl，室溫放置 15~20 min。轉(zhuǎn)染 48 h 后采用非變性裂解液充分裂解，取上清，加入40μl 充分重懸的抗FLAG-M2 親和凝膠（ANTI-FLAG M2 affinity gel）或抗HA 親和凝膠（EZviewTMRed Anti-HA Affinity Gel）4 ℃ 緩 慢 搖 動 2 h，8 000 r/min 離 心1 min，棄上清，PBS 洗滌5 次后去除上清，加入40 μl RIPA 裂解液和 10 μl 5×SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，100 ℃沸水浴5 min；取20 μl樣品用于SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用Nrf2 特異性抗體（1∶2 000）、p62 特異性抗體（1∶1 000）分別進(jìn)行檢測。

1.2.7 質(zhì)譜鑒定Nrf2免疫復(fù)合物 轉(zhuǎn)染前將HeLa細(xì)胞接種至100 mm 培養(yǎng)皿，融合率達(dá)到60%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將待轉(zhuǎn)FLAG-Nrf2質(zhì)粒5.0μg加入至1 ml opti-MEM，滴加轉(zhuǎn)染試劑 15 μl，室溫放置15~20 min。轉(zhuǎn)染48 h 后采用非變性裂解液充分裂解，取上清，加入40μl充分重懸的抗FLAG-M2親和凝膠（ANTI-FLAG M2 affinity gel）4 ℃緩慢搖動2 h，8 000 r/min 離心 1 min，棄上清，PBS 洗滌 5 次后去除上清，加入40 μl RIPA 裂解液和10 μl 5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100 ℃沸水浴5 min；取20 μl 樣品用于SDS-PAGE 電泳，銀染后切膠條，進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果

2.1SQSTM1基因擴(kuò)增及真核表達(dá)載體構(gòu)建 以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SQSTM1基因。電泳結(jié)果顯示，約1 100 bp 處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖2），與預(yù)測目的片段大小一致。重組真核表達(dá)質(zhì)粒nFLAG-SQSTM1/pRK5 經(jīng)BamHⅠ單酶切后的DNA電泳結(jié)果見圖3，質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)BLAST 對比與GenBank檢索獲取的SQSTM1基因序列完全一致。

圖2 PCR擴(kuò)增SQSTM1基因Fig.2 Amplification of SQSTM1 gene by PCR

圖3 nFLAG-SQSTM1/pRK5質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ單酶切電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of plasmid nFLAG-SQSTM1/pRK5 single restriction digested by BamH Ⅰ

2.2 p62 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FLAG-p62 質(zhì)粒組采用p62 蛋白特異性抗體檢測后出現(xiàn)明顯特異性條帶，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染nFLAG/pRK5 空載體質(zhì)粒組未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，表明p62 目的蛋白表達(dá)成功（圖4）。

圖4 Western blot檢測p62蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of p62 protein detected by Western blot

2.3 p62 蛋白與Nrf2 蛋白相互作用 Western blot結(jié)果顯示，抗FLAG-M2 親和凝膠免疫共沉淀后，采用 Nrf2 抗體檢測，HA-Nrf2 和 FLAG-p62 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組（泳道4）在110 kD 處可檢測到條帶，蛋白大小與Nrf2蛋白一致；而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照組、轉(zhuǎn)染HA-Nrf2質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染FLAG-p62 質(zhì)粒組未檢測到Nrf2 蛋白相應(yīng)條帶（泳道1、2、3）。同樣在抗-HA 親和凝膠免疫共沉淀后，HA-Nrf2 和FLAG-p62 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組（泳道4）在62 kD 處檢測到條帶，蛋白大小與p62 蛋白一致；而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照組、轉(zhuǎn)染HA-Nrf2質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染FLAG-p62 質(zhì)粒組未檢測到p62 蛋白相應(yīng)條帶（泳道1、2、3）。Input 組Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 HA-Nrf2 質(zhì)粒組、HA-Nrf2 和 FLAG-p62 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)組均可在110 kD 處檢測到Nrf2 蛋白特異性條帶；轉(zhuǎn)染 FLAG-p62 質(zhì)粒組、HA-Nrf2 質(zhì)粒和 p62 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組均可在62 kD 處檢測到p62 蛋白特異性條帶（圖5）。表明Nrf2 蛋白與p62 蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。

圖5 免疫共沉淀檢測Nrf2-p62蛋白相互作用Fig.5 Interaction of Nrf2-p62 proteins by immunoprecipitation

采用抗FLAG-M2 親和凝膠分離FLAG 標(biāo)簽融合蛋白，即捕獲Nrf2 蛋白免疫復(fù)合物樣品進(jìn)行銀染，銀染結(jié)果見圖6A。Western blot結(jié)果顯示免疫共沉淀得到Nrf2 免疫復(fù)合物（圖6B）。Nrf2 免疫復(fù)合物經(jīng)質(zhì)譜檢測共鑒定到666 個(gè)蛋白，2 920 個(gè)肽段，其中鑒定到內(nèi)源性p62 蛋白，證實(shí)Nrf2 與p62 存在相互作用（表1）。

圖6 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證Nrf2免疫沉淀物Fig.6 Verification of immunoprecipitate of Nrf2 by SDSPAGE and Western blot

表1 p62-Nrf2蛋白復(fù)合物質(zhì)譜鑒定Tab.1 Identification of p62-Nrf2 protein complex by mass spectrometry

3 討論

細(xì)胞自噬可清除錯(cuò)誤折疊蛋白和導(dǎo)致線粒體損傷的物質(zhì)，從而協(xié)助細(xì)胞存活［14］。p62 是一種自噬相關(guān)接頭蛋白，作為受體參與清除泛素化蛋白過程。p62 蛋白對腫瘤發(fā)生具有雙重調(diào)節(jié)作用。當(dāng)自噬功能正常時(shí)，p62 對腫瘤起抑制作用［15］；但在肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中p62表達(dá)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞［16-17］。

Keap1-Nrf2信號通路是最重要的氧化應(yīng)激防御機(jī)制之一［8，18］，SQSTM1作為轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2 啟動的靶基因，可通過Keap1-Nrf2-ARE 通路產(chǎn)生正反饋環(huán)［4，19-21］。近年研究發(fā)現(xiàn)，過量 ROS 可引起 p62 蛋白Ser403 和Ser351 位磷酸化，磷酸化的p62 通過KIR區(qū)域結(jié)合Keap1 使Nrf2 解離并活化，而持續(xù)的Nrf2激活可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［11，22］。人 EBV 陽性 B 淋巴瘤細(xì)胞中，EBV 感染產(chǎn)生的活性氧誘導(dǎo)p62 累積并激活Keap1-Nrf2 信號通路，過量的p62 增強(qiáng)了細(xì)胞選擇性自噬，并促進(jìn)蛋白酶體對DNA 修復(fù)蛋白CHK1 和RAD51的降解，誘導(dǎo)腫瘤形成［23］。

因此，研究p62 與Nrf2 蛋白的關(guān)系對闡明腫瘤形成與進(jìn)展具有重要意義。本研究構(gòu)建了p62表達(dá)載體，在HEK293T 細(xì)胞中成功表達(dá)p62 蛋白，為p62蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上通過免疫共沉淀和質(zhì)譜驗(yàn)證了p62蛋白與Nrf2蛋白的相互作用。但本研究的局限性在于無法通過免疫沉淀物判斷p62與Nrf2形成的復(fù)合物是否存在其他生物分子，且p62-Nrf2 蛋白復(fù)合物的生物學(xué)功能以及p62蛋白與Nrf2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)尚未闡明。

綜上所述，本研究認(rèn)為p62 蛋白在Keap1-Nrf2通路中不僅可通過自噬降解Keap1從而促進(jìn)Nrf2蛋白累積和入核，還可與Nrf2 蛋白形成復(fù)合物。但目前p62-Nrf2 蛋白復(fù)合體功能以及p62 蛋白與Nrf2 蛋白結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚。課題組將進(jìn)一步確定p62蛋白與Nrf2 蛋白的連接方式、相互作用位點(diǎn)以及p62-Nrf2復(fù)合物的生物學(xué)功能。