徐萬超 虞堅(jiān)爾 薛 征⑤ 樸 香 楊 艷 胡逸中

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院兒科，上海 200137）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）簡(jiǎn)稱哮喘，是一種以氣道慢性炎癥為特征的臨床常見疾病，主要表現(xiàn)為喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，影響全世界超過3 億人口，嚴(yán)重威脅全球人類的健康［1］。哮喘發(fā)作是由于氣道吸入塵螨、煙霧、病原體、致敏顆粒等物質(zhì)，進(jìn)而刺激初始T 細(xì)胞（na?ve T cell，Tn）向輔助型 T 細(xì)胞（T helper cell，Th）2 分化，導(dǎo)致 Th1/Th2 免疫失衡并分泌促炎因子，最終引起氣道炎癥。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的免疫復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）、前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（pro-caspase-1）三部分構(gòu)成，可識(shí)別吸入氣道的多種物質(zhì)引起Th2分化，與哮喘發(fā)病密切相關(guān)［2］。

平喘方是海派中醫(yī)徐氏兒科治療哮喘經(jīng)典方，前期研究發(fā)現(xiàn)平喘方可干預(yù)哮喘小鼠樹突狀細(xì)胞分化，增加吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO）、T 盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-box expressed in T cells，T-bet）表達(dá)，減少腫瘤壞死因子配體超家族成員 4［tumor necrosis factor（ligand）superfamily，member 4，TNFSF4］、轉(zhuǎn)錄因子 GATA 結(jié)合蛋白3（transcription factors GATA binding protein-3，GATA-3）表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫平衡，減輕哮喘氣道炎癥［3-4］，故推測(cè)平喘方可能對(duì)NLRP3 信號(hào)通路發(fā)揮干預(yù)作用。本研究運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，觀察平喘方干預(yù)哮喘模型小鼠NLRP3 炎癥信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)，為中醫(yī)藥臨床治療哮喘提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5~6 周齡 SPF 級(jí)雄性 BALB/c 小鼠共40 只，體質(zhì)量18~22 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境為：室溫24 ℃、濕度50%~70%，12 h 日光燈模擬晝夜更替，各組小鼠可自由飲水與進(jìn)食。

1.1.2 藥物 中藥材購(gòu)于上海市藥材公司，平喘方原方組成為炙麻黃6 g、苦杏仁9 g、紫蘇子9 g、萊菔子9 g、桃仁6 g、地龍9 g、花椒目9 g、炙甘草6 g，藥物煎煮時(shí)按照1∶1.5∶1.5∶1.5∶1∶1.5∶1.5∶1 的比例組方。中藥平喘方煎煮方法參考李儀奎主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［5］，將草藥混合后加13 倍水，頭煎武火煮沸后文火煮30 min，用紗布將藥液濾出，二煎加11 倍水煮沸后文火煮30 min，頭煎二煎混合后濃縮。醋酸地塞米松片產(chǎn)于上海上藥信誼藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字：HB102079。平喘方濃縮后根據(jù)人每天服藥劑量進(jìn)行公式換算，計(jì)算公式為：dB=dA×KB/KA［設(shè)算系數(shù)為K，dA為A種動(dòng)物的劑量（mg/只），dB 為B 種動(dòng)物的劑量（mg/只），其中70 kg 人與20 g小鼠的KB/KA=0.002 5）］，計(jì)算小鼠每天服藥劑量，經(jīng)計(jì)算平喘方灌胃濃度為含生藥量5.33 g/ml。

1.1.3 主要試劑與儀器 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）（Sigma，貨號(hào)：A5503，25 g）；鎂鋁佐劑（Thermo，貨號(hào)：77161）；NLRP3抗體（BIOSS，貨號(hào)：bs-6655R）；caspase-1抗體（Abcam，貨號(hào)：ab138483）；IL-1β ELISA試劑盒（X-Y Biotechnology，貨號(hào)：E20533）；IL-18 ELISA 試劑盒（X-Y Biotechnology，貨號(hào)：E11385）；Trizol（Invitrogen，貨號(hào)：1596-026）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo，貨號(hào)：K0223）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，貨號(hào)：K1622）；石蠟（上海國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：69018961）；DAB 濃縮型試劑盒（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：FL-6001）；蘇木素（BASO，貨號(hào)：714094）；伊紅（BASO，貨號(hào)：BA4099）。

Real-time PCR 檢測(cè)儀（ABI 公司，型號(hào)：ABI-7300）；低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TG-16M）；旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，型號(hào)：K30）；電動(dòng)勻漿機(jī)（FLUKO，型號(hào)：PRO200）；移液器（吉爾森P 型移液，型號(hào)：Pipetman）；水浴鍋（Leica，型號(hào)：HI1210）；石蠟切片機(jī)（徠克公司，型號(hào)：SQ2125）；顯微圖像分析系統(tǒng)（NIKON公司，型號(hào)：DS-Ri2）；正置顯微鏡（Olympus 公司，型號(hào)：CX41）；超聲霧化器（PARI GmbH，型號(hào)：PARI BOY N）；霧化箱（自制，40 cm×30 cm×25 cm泡沫箱）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型制備 將40 只雄性BALB/c小鼠按1∶3 分為空白對(duì)照組（Control）10 只、哮喘模型組（Model）30 只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始造模，哮喘模型小鼠分別于第1 天、第14 天腹腔注射0.5 ml 致敏液（0.375 ml 生理鹽水+50 mg OVA+0.125 ml鋁鎂佐劑），空白對(duì)照組以等量生理鹽水腹腔注射；第21~27天將小鼠置于密閉霧化箱中，模型組小鼠以5%OVA 霧化30 min，空白對(duì)照組小鼠以等劑量生理鹽水霧化30 min，1次/d，共7 d。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 哮喘小鼠致敏完畢后，將哮喘模型組的30 只小鼠按照《醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》［6］中隨機(jī)數(shù)字表分為3 組，即哮喘模型（Model）組、地塞米松（DEX）組、平喘方（PCF）組，10 只/組。各組小鼠于當(dāng)日霧化激發(fā)1 h 后灌胃給藥治療，每只小鼠以0.5 ml（/次·d）灌胃，DEX 組用蒸餾水配制成濃度為0.075 mg/ml的地塞米松溶液，空白組和模型組小鼠以等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.3.1 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理改變情況 處死小鼠后打開小鼠胸腔，用剪刀將小鼠右側(cè)中葉肺剪下，放入提前準(zhǔn)備的10%甲醛溶液中以備石蠟包埋做病理染色切片。將由甲醛固定的肺組織放入包埋盒中，分別置于流水及不同濃度的乙醇中脫水，于二甲苯中脫蠟后包埋肺組織。將包埋好的組織蠟塊切至每片4~7μm，脫蠟水化后經(jīng)蘇木精、伊紅染色，樹脂封片，運(yùn)用光學(xué)顯微鏡在200 倍鏡下觀察。

1.2.3.2 免疫組化檢測(cè)NLRP3、caspase-1 在肺組織中陽性表達(dá) 取石蠟包埋好的肺組織樣本切片置于玻片，經(jīng)脫蠟、水化后，采用檬酸鈉緩沖溶液抗原修復(fù) 15 min，而后 PBS 沖洗 3 次，3 min/次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后按照最佳稀釋比例滴加一抗，室溫下孵育1 h 后PBS 沖洗3 次，加入二抗孵育30 min 后，DAB 及蘇木精染色，最終置于二甲苯中透明并封片。顯微鏡拍照后分析相關(guān)部位，并用Image J軟件計(jì)算陽性面積。

1.2.3.3 Western blot 檢測(cè)肺組織 NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá) 取小鼠左側(cè)肺組織，剪成細(xì)小的碎片，每20 mg 組織加入150~250 μl 裂解液的比例加入裂解液，待勻漿組織完全裂解后離心取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量及膠的制備。80 V 電泳后進(jìn)行120 V 轉(zhuǎn)膜，然后用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕，將膠直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。轉(zhuǎn)膜后將膜放入TBST 清洗1 次，再置于麗春紅染色工作液中，室溫下?lián)u動(dòng)染色5 min，水洗膜直至水變清無色、蛋白條帶清晰后進(jìn)行封閉及抗原孵育，抗體根據(jù)說明書稀釋。一抗孵育過夜后，TBST洗膜3次，5 min/次，隨后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h 后配制ECL 發(fā)光液，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5 min 后棄顯色液，并蓋上透明紙，將其放入成像系統(tǒng)中成像，調(diào)整感光時(shí)間達(dá)到理想結(jié)果。以灰度值計(jì)算Western blot結(jié)果。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）法檢測(cè)肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)水平 取小塊待測(cè)肺組織，加入裂解液進(jìn)行裂解，Trizol 試劑提取小鼠不同組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，上機(jī)后通過PCR 儀檢測(cè)記錄各反應(yīng)管中產(chǎn)生的熒光信號(hào)制作擴(kuò)增曲線，并通過記錄擴(kuò)增次數(shù)記錄循環(huán)數(shù)，最終得到每個(gè)樣本的Ct值，使用2-ΔCt測(cè)出各組的組織中待測(cè)基因表達(dá)水平，并附引物序列（表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3.5 ELISA 檢測(cè)肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中 IL-1β、IL-18 表達(dá)水平 小鼠脫頸椎處死后，打開胸腔，剪開主氣管，用線結(jié)扎右側(cè)支氣管，將1 ml 注射器針頭與剪斷的主氣管相連，將1 ml生理鹽水打入小鼠左肺灌洗2~3次，最終取得灌洗液約0.6 ml，放入凍存管中凍存待測(cè)。常溫下解凍后離心取上清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作，按照濃度梯度將每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品，并按說明書將肺泡灌洗液稀釋后加入其他孔內(nèi)，37 ℃溫育30 min，配液洗滌、加酶等操作后，加入A、B 兩種顯色劑各50μl 顯色30 min，在450 nm 處測(cè)吸光度值，而后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18的實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析，并用LSD、SNK法進(jìn)行組間兩兩比較；若不符合正態(tài)性及方差齊性數(shù)據(jù)則采用秩和檢驗(yàn)比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模及給藥干預(yù)后各組小鼠一般行為情況模型組小鼠造模后易激惹躁動(dòng)，上肢搔抓口鼻，腹肌抽動(dòng)，毛發(fā)豎立，霧化期間二便明顯增多；與哮喘模型組相比，地塞米松組及平喘方組小鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，呼吸較模型組平穩(wěn)，毛發(fā)平順，反應(yīng)靈敏，二便逐漸恢復(fù)正常。

2.2 HE 染色觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果空白對(duì)照組小鼠氣管、支氣管黏膜上皮完整，管腔通暢無滲出，管壁肌層及管周組織為無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡及周圍組織結(jié)構(gòu)完好，無紅細(xì)胞及炎癥物質(zhì)滲出。哮喘模型組小鼠支氣管周圍可見充血，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道管腔狹窄，基底膜增厚，氣道上皮細(xì)胞遭到破壞，肺泡組織可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥物質(zhì)滲出。與哮喘模型組相比，DEX 組和PCF組均可有效改善氣道及肺泡組織炎癥性物質(zhì)滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕氣道炎癥。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理HE染色觀察（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of mice in each group by HE staining（×200）

2.3 Western blot 檢測(cè)各組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)

2.3.1 各組NLRP3 蛋白表達(dá) 與空白組相比，各組 NLRP3 表達(dá)均升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX組和PCF組表達(dá)均降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF組NLRP3蛋白表達(dá)升高（P＞0.05）。見表2、圖2。

2.3.2 各組caspase-1 蛋白表達(dá) 與空白組相比，模型組、DEX 組、PCF 組 caspase-1 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和 PCF 組表達(dá)均降低（P＜0.05）；與 DEX 組相比，PCF 組 caspase-1 蛋白表達(dá)增多（P＞0.05）。見表2、圖2。

2.3.3 各組ASC 蛋白表達(dá) 與空白組相比，模型組 ASC 表達(dá)升高（P＜0.05），DEX 組、PCF 組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組表達(dá)均降低（P＜0.05）；與 DEX 組相比，PCF組ASC 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)肺組織中NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of NLRP3，caspase-1 and ASC protein in lung tissue detected by Western blot

表2 各組 NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3，ASC and caspase-1 proteins in each group（，n=10）

表2 各組 NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3，ASC and caspase-1 proteins in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with DEX group，3）P＜0.05.

ASC/GAPDH 0.32±0.12 0.82±0.181）0.41±0.092）0.52±0.132）Groups Control Model DEX PCF NLRP3/GAPDH 0.18±0.12 0.88±0.121）0.33±0.131）2）0.63±0.121）2）3）caspase-1/GAPDH 0.11±0.03 1.04±0.111）0.41±0.121）2）0.62±0.241）2）3）

2.4 免疫組化檢測(cè)各組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1 陽性表達(dá)面積 與空白組相比，模型組、PCF組 NLRP3、caspase-1 陽性面積增多（P＜0.05），DEX組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組表達(dá)均減少（P＜0.05）；與DEX 組相比，PCF 組 NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積增多（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 免疫組化檢測(cè)肺組織中NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)（×200）Fig.3 Expressions of NLRP3 and caspase-1 proteins in lung tissue detected by immunohistochemistry（×200）

表3 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積比較（，n=10）Tab.3 Comparison of positive area of NLRP3 and caspase-1 protein in each group（，n=10）

表3 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積比較（，n=10）Tab.3 Comparison of positive area of NLRP3 and caspase-1 protein in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with DEX group，3）P＜0.05.

caspase-1 295.4±42.45 914.8±202.221）431.2±80.242）661.2±100.151）2）3）Groups Control Model DEX PCF NLRP3 199.0±47.56 626.6±68.921）216.2±44.842）404.4±85.481）2）3）

2.5 RT-PCR 檢測(cè)各組肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá) 與空白組相比，模型組、PCF 組NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），DEX組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組 NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF組NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)比較（，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NLRP3 and caspase-1 of mice in each group（，n=10）

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)比較（，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NLRP3 and caspase-1 of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05.

caspase-1 0.007±0.002 0.020±0.0041）0.010±0.0022）0.014±0.0041）2）Control Model DEX PCF 0.006±0.002 0.018±0.0041）0.009±0.0032）0.012±0.0031）2）GroupsNLRP3

2.6 ELISA法檢測(cè)平喘方對(duì)哮喘小鼠BALF中炎癥因子影響

2.6.1 各組IL-1β 的因子表達(dá) 與空白組相比，模型組IL-1β 表達(dá)升高（P＜0.05），DEX 組、PCF 組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX組、PCF 組IL-1β 因子表達(dá)均降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF 組 IL-1β 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

2.6.2 各組IL-18的因子表達(dá) 與空白組相比，各組IL-18表達(dá)均升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX組和PCF 組表達(dá)均降低（P＜0.05）；與DEX 組相比，PCF組IL-18表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠 BALF 中 IL-1β、IL-18 因子表達(dá)比較（，n=10，pg/ml）Tab.5 Comparison of BALF expressions of IL-1β and IL-18 in each group（，n=10，pg/ml）

表5 各組小鼠 BALF 中 IL-1β、IL-18 因子表達(dá)比較（，n=10，pg/ml）Tab.5 Comparison of BALF expressions of IL-1β and IL-18 in each group（，n=10，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05.

IL-18 90.82±24.50 185.62±30.951）134.29±28.311）2）150.52±17.721）2）Groups Control Model DEX PCF IL-1β 65.19±6.80 120.83±22.951）79.84±21.292）81.40±15.772）

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，發(fā)作時(shí)Th2相關(guān)的IL-4、IL-5、IL-13 等炎癥因子分泌增加，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞增多、氣道黏液分泌過剩，伴隨氣道高反應(yīng)性等情況出現(xiàn)［7］。哮喘中的NLRP3炎癥小體可通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）激活，識(shí)別病原體、各類毒素、微生物及代謝物的刺激［8］。在經(jīng)典的激活途徑下，NLRP3可在激酶NEK7（NIMA-related kinase 7）的作用下分離出caspase-1，而后在 NF-κB 的參與下，令 proIL-1β 和 proIL-18 中的前體分離，并最終生成IL-1β與IL-18炎癥因子［9］。IL-1β 在哮喘中可誘導(dǎo) Th2、Th17 導(dǎo)致氣道炎癥［10］，還能調(diào)控NF-κB 通路，并進(jìn)一步上調(diào)趨化因子、黏附分子、補(bǔ)體系統(tǒng)等的表達(dá)［11］。NLRP3 還可能是治療類固醇耐受型的中性粒細(xì)胞哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)，給予哮喘小鼠外源性的IL-1β 會(huì)加重小鼠對(duì)類固醇的耐受，但NLRP3 炎癥小體加重此類哮喘的機(jī)制研究仍待完善［12］。

哮喘屬于中醫(yī)“哮病”“喘證”的范疇。中醫(yī)認(rèn)為小兒哮喘的病因病機(jī)在于肺、脾、腎常不足，痰阻氣道，機(jī)體受外界刺激后引動(dòng)伏痰而發(fā)?！疤怠睘橄l(fā)病的主要病理因素，中醫(yī)理論中“痰”不僅包括氣道黏液等分泌物，還可將哮喘相關(guān)炎癥細(xì)胞、炎癥因子等致病因素納入“無形之痰”的范疇［13］，因此中醫(yī)治療哮喘常選用化痰平喘藥物。同時(shí)，導(dǎo)師虞堅(jiān)爾教授認(rèn)為“血瘀”是哮喘發(fā)病的另一病理因素，患兒先天稟賦不足、肺脾氣虛，血行不暢，肺中內(nèi)生瘀血，與“痰”相合作用產(chǎn)生痰瘀互結(jié)之象，令哮喘遷延難愈。相關(guān)研究認(rèn)為，中醫(yī)“血瘀”可將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中炎癥反應(yīng)包含在內(nèi)，如臨床在運(yùn)用激素治療哮喘時(shí)常伴有血液黏稠度增高、血栓素B2 升高，進(jìn)而影響血小板和血流變的指標(biāo)，加重肺部瘀血及氣道炎癥，當(dāng)歸可通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB 炎癥通路緩解氣道炎癥和血瘀狀態(tài)，達(dá)到治療哮喘的目的［14］。本實(shí)驗(yàn)中平喘方是海派徐氏兒科治哮經(jīng)典方，具有宣肺平喘、化痰祛瘀之功。全方以炙麻黃為君、苦杏仁為臣，功可宣肺平喘，紫蘇子、萊菔子、花椒目可降氣化痰，桃仁、地龍可活血祛瘀，共同治療哮喘“痰瘀互結(jié)”病機(jī)與病理產(chǎn)物。

本次研究通過HE 病理觀察發(fā)現(xiàn)，平喘方可改善哮喘小鼠氣道管壁狹窄，減輕氣道周圍及肺泡組織炎性物質(zhì)滲出，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化顯示平喘方可減少氣道及肺泡上皮細(xì)胞NLRP3、caspase-1 陽性表達(dá)。經(jīng)平喘方干預(yù)后，哮喘小鼠肺中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白及相關(guān)基因表達(dá)降低，BALF 中 IL-1β、IL-18 炎癥因子的分泌減少，療效優(yōu)于哮喘模型組，與陽性對(duì)照藥地塞米松組比較，平喘方在降低 IL-1β、IL-18 分泌及 NLRP3、caspase-1 mRNA 表達(dá)等方面療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)略高于地塞米松治療組。研究結(jié)果顯示平喘方可通過減少NLRP3 的活化抑制caspase-1表達(dá)，進(jìn)而減少IL-1β、IL-18炎癥因子的分泌，改善哮喘小鼠氣道炎癥情況。

綜上，平喘方可改善哮喘小鼠的氣道炎癥情況，其作用可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路的活化，減少IL-1β、IL-18 炎癥因子的分泌，最終緩解哮喘氣道炎癥。然而，本研究中的平喘方為復(fù)方中藥，具體干預(yù)NLRP3 炎癥小體活化的分子化合物仍不明確，未來針對(duì)中醫(yī)藥復(fù)方的作用靶點(diǎn)與機(jī)制的研究仍在進(jìn)一步探索中，中醫(yī)藥復(fù)方由多種中藥材組成，下一階段可根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及指紋圖譜篩選等方法對(duì)平喘方的主要作用單體進(jìn)行篩選并研究，以期為中醫(yī)藥臨床治療哮喘提供一定的參考。