龍 舉，曾軍杰，梅光明

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021)

近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國(guó)對(duì)石油的進(jìn)口量也逐年遞增[1]，進(jìn)而大型油船事故也隨之增加[2]。2018 年1 月6 日，巴拿馬籍油船“桑吉”輪與香港籍散貨船“長(zhǎng)峰水晶”輪在東海海域發(fā)生碰撞，導(dǎo)致“桑吉”輪全船失火，13.6 萬(wàn)t 船載石油進(jìn)入海洋中[3]。油船事故的發(fā)生無(wú)疑會(huì)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成不可估量的巨大損害[4]，石油烴(petroleum hydrocarbon)則已成為我國(guó)海域海洋污染因子中最主要的物質(zhì)之一[5]，尤其是石油烴中芳香烴類(lèi)物質(zhì)會(huì)對(duì)海洋生物的成長(zhǎng)造成巨大的危害[6]。石油烴在海洋中能被膠體顆粒物和懸浮顆粒物所吸附[7]，再通過(guò)海洋生物的體膚滲透以及呼吸代謝后蓄積在生物體內(nèi)，一方面導(dǎo)致海洋生物體型變化直至畸形[8]，另一方面海洋生物的生長(zhǎng)繁殖也會(huì)受影響[9]。海洋生物通過(guò)生物富集作用吸收了水體中的石油烴后[10]，通過(guò)眾多常見(jiàn)海捕魚(yú)直接影響著人類(lèi)的食品安全[11]。因此，大批量準(zhǔn)確快速測(cè)定海捕魚(yú)中石油烴含量能及時(shí)提供科學(xué)可靠的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)保障人們食品安全方面具有重大意義?，F(xiàn)行的檢測(cè)石油烴的方法相對(duì)較為成熟，其主要有紫外分光光度法[12]、紅外光度法[13]、重量法[14]、熒光分光光度法[15]、液相色譜法[16]以及氣相色譜法[17]等。本實(shí)驗(yàn)基于《GB 17378.6-2007 國(guó)家海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范(第六部分:生物體分析)》[18]，對(duì)樣品前處理操作過(guò)程、時(shí)間選擇、試劑使用量等進(jìn)行了合理分配，操作上去繁就簡(jiǎn)、合理規(guī)范，大大縮短了樣品處理的時(shí)間。利用三維相關(guān)光譜技術(shù)分析了熒光條件Ex/Em=230/280 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 時(shí)石油烴熒光強(qiáng)度及加標(biāo)回收率。通過(guò)本研究，得到結(jié)果準(zhǔn)確、能滿(mǎn)足海捕魚(yú)中石油烴大批量檢測(cè)的方法，并歸納總結(jié)了海捕魚(yú)中石油烴測(cè)定實(shí)驗(yàn)須注意的一些問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品均為海捕魚(yú)類(lèi)，清水洗凈后取海捕魚(yú)可食肌肉部分用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻，-18 ℃冷凍保存。

試驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水；氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇，優(yōu)級(jí)純；石油醚(沸點(diǎn)范圍60～90 ℃)，分析純；二氯甲烷，色譜純；

6 mol·L-1氫氧化鈉溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取240 g 氫氧化鈉，加水溶解并定容到1 000 mL(按需要可同比例增加或減少)冷卻至室溫備用；

飽和氯化鈉溶液:用40 ℃溫水配制飽和氯化鈉溶液，待冷卻至室溫后形成過(guò)飽和氯化鈉溶液備用；

脫芳石油醚:石油醚經(jīng)60 目活性炭層析柱約每分鐘60～100 滴流速過(guò)柱處理后收集備用；石油類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度:1 000 mg·L-1(±3%)，購(gòu)于國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心；原始編號(hào):GBW(E) 080913；有效期:室溫保存3 個(gè)月。

石油類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)使用液:取石油類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL 于50.0 mL 棕色容量瓶中用石油醚稀釋并定容至刻度得100.0 mg·L-1石油類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)使用液，3 個(gè)月內(nèi)使用。

1.1.2 儀器設(shè)備

RF-600 型熒光光譜儀(島津通用儀器有限責(zé)任公司)；可調(diào)溫水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buch 公司)；分液漏斗振蕩器、THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))；活性炭層析柱(滁州長(zhǎng)城玻璃儀器制造廠(chǎng))；臺(tái)式天平(SL-502 型，上海華巖設(shè)備儀器有限公司)；電子天平(AL204 型，瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；組織搗碎機(jī)(T18 基本型，托利多儀器有限公司)；具塞皂化瓶，聚四氟乙烯分液漏斗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱(chēng)取(2.0±0.2) g 完全解凍的樣品于100 mL 皂化瓶中，加入6 mol·L-1氫氧化鈉溶液20 mL，手動(dòng)振蕩混合均勻，轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器中需避光40 ℃、1 500 r·min-1振蕩皂化6 h，皂化完全后瓶中無(wú)塊狀樣品。加入20 mL 無(wú)水乙醇搖晃使反應(yīng)混合更加充分，靜置2 h 后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯分液漏斗中。分別用二氯甲烷10 mL 沖洗皂化瓶2 次均倒入分液漏斗中，加入100 mL 水和30 mL 飽和氯化鈉溶液防止乳化，手動(dòng)搖晃適當(dāng)放出氣體后再放置到分液漏斗振蕩器2 500 r·min-1振蕩2 min，充分萃取后靜置至明顯分層，收集下層二氯甲烷于雞心瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速10～15 r·min-1為宜)濃縮至干，冷卻到室溫后加入10 mL脫芳石油醚，搖晃雞心瓶使內(nèi)壁充分蕩洗后靜置待測(cè)，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)

設(shè)置RF-600 型熒光光譜儀的狹縫寬度均為5 nm，光譜儀的掃描速度為10 000 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的采樣間隔分別為5 nm 和2 nm；激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均設(shè)置為200～450 nm。濃度為5.0 mg·L-1的石油烴標(biāo)準(zhǔn)液三維相關(guān)光譜如圖1 所示。由圖1 可知，石油烴的三維相關(guān)光譜主要存在2 個(gè)明顯的熒光特征峰，中心峰位于Ex/Em=230/340 nm 附近的熒光峰和位于Ex/Em=270/314 nm 附近的熒光峰，石油烴在Ex/Em=270/314 nm位置具有最大熒光強(qiáng)度?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《GB 17378.6-2007 國(guó)家海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范(第六部分:生物體分析)》中使用Ex/Em=310/360 nm位置熒光強(qiáng)度則較弱。

圖1 5.0 mg·L-1 石油標(biāo)準(zhǔn)溶液三維相關(guān)光譜圖Fig.1 Three-dimensional correlation of petroleum hydrocarbon at 5.0 mg·L-1

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

根據(jù)1.2.2 所得石油烴特征峰光譜條件和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中光譜條件，分別取油標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以樣品相同的條件進(jìn)行皂化反應(yīng)及萃取、濃縮、復(fù)溶等操作，采用Ex/Em=310/360 nm條件下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，以熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)Y，石油烴的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 樣品測(cè)定

海捕魚(yú)樣品經(jīng)皂化、萃取、濃縮、復(fù)溶靜置沉淀后，轉(zhuǎn)移適量上清液至1 cm 光程的適應(yīng)比色皿中進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)其在Ex/Em=310/360 nm 條件下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出海捕魚(yú)樣品中石油烴含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化條件的選擇

2.1.1 樣品狀態(tài)

由于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)皂化條件過(guò)于耗時(shí)耗力，本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)中影響皂化結(jié)果的條件主要有樣品狀態(tài)、樣品種類(lèi)、皂化溫度、搖動(dòng)力度及頻率、皂化時(shí)間等。海捕魚(yú)樣品-18 ℃冷凍保存后為堅(jiān)硬塊狀，若解凍不充分，則大大延長(zhǎng)了皂化時(shí)間，且影響皂化進(jìn)度及效果，故樣品需充分解凍為肉糜狀后方可進(jìn)行皂化，在批量檢測(cè)海捕魚(yú)樣品中石油烴時(shí)可提前對(duì)相應(yīng)的樣品進(jìn)行解凍。以鰻魚(yú)樣品和黃姑魚(yú)樣品為例，未充分解凍海捕魚(yú)樣品對(duì)皂化結(jié)果的影響見(jiàn)表1。

表1 海捕魚(yú)樣品狀態(tài)對(duì)皂化結(jié)果的影響Tab.1 Effect of sea fishes sample status on saponification results

2.1.2 皂化條件

樣品的皂化過(guò)程是由過(guò)量的氫氧化鈉作為反應(yīng)物質(zhì)的復(fù)雜反應(yīng)[19]。皂化條件主要包括溫度、振蕩轉(zhuǎn)速及時(shí)間，在一定范圍內(nèi)，提高溫度、加大振蕩轉(zhuǎn)速均有利于縮短皂化過(guò)程的時(shí)間。批量檢測(cè)海捕魚(yú)樣品中石油烴含量的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室常用使樣品皂化過(guò)程保持一定溫度的方式有恒溫水浴和恒溫氣浴2 種[20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):恒溫水浴和恒溫氣浴2 種方式對(duì)皂化時(shí)間及皂化效果無(wú)明顯差異，而恒溫氣浴則更加方便操作，故本實(shí)驗(yàn)選擇恒溫氣浴方式進(jìn)行。樣品皂化過(guò)程溫度選擇實(shí)驗(yàn)使用恒溫氣浴振蕩器，振蕩轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1下分別選擇氣浴溫度30、35、40、45 ℃進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣溫越高皂化速度越快，在溫度40 ℃時(shí)選擇的4 種海捕魚(yú)樣品均能在不超過(guò)6 h 就完全皂化；溫度45 ℃時(shí)雖然皂化耗時(shí)更短，但不明顯，且皂化瓶玻璃塞常有沖出，導(dǎo)致皂化液體濺出，故本實(shí)驗(yàn)選擇氣浴溫度為40 ℃。多種海捕魚(yú)樣品皂化反應(yīng)耗時(shí)見(jiàn)表2。

表2 海捕魚(yú)樣品皂化反應(yīng)耗時(shí)表Tab.2 Time of sea fishes sample saponification reaction

2.2 熒光條件

文獻(xiàn)中關(guān)于熒光條件選擇以《GB 17378.6-2007 國(guó)家海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范(第六部分:生物體分析)》為準(zhǔn)，即Ex/Em=310/360 nm 時(shí)測(cè)定樣品中石油烴熒光強(qiáng)度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品石油烴含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)石油烴標(biāo)準(zhǔn)品在激發(fā)波長(zhǎng)200～450 nm 范圍、發(fā)射波長(zhǎng)在200～450 nm 范圍進(jìn)行三維熒光掃描后發(fā)現(xiàn):石油烴標(biāo)準(zhǔn)品在Ex/Em=230/340 nm 時(shí)具有最高熒光強(qiáng)度響應(yīng)值，在Ex/Em=270/314 nm 時(shí)具有較高熒光強(qiáng)度響應(yīng)值，而在Ex/Em=310/360 nm 時(shí)熒光強(qiáng)度響應(yīng)值很低。在3 組熒光條件下分別做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果顯示在Ex/Em=310/360 nm 時(shí)回收率能滿(mǎn)足樣品檢測(cè)質(zhì)控要求，而另外2 組熒光條件回收率都偏高。故熒光條件選擇Ex/Em=310/360 nm。

圖2 試劑空白三維相關(guān)光譜圖Fig.2 Three-dimensional correlation of reagent blank

圖3 鰻魚(yú)樣品三維相關(guān)光譜圖Fig.3 Three-dimensional correlation of eel samples

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性方程

根據(jù)1.2.2 所得石油烴特征峰光譜條件和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中光譜條件，分別取石油標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以樣品相同的條件進(jìn)行皂化反應(yīng)及萃取、濃縮、復(fù)溶等操作，采用Ex/Em=230/340 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 條件下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，以熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)Y，石油烴的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，3 組熒光條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖4。線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，可滿(mǎn)足石油烴定量要求。

圖4 石油烴測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.4 Standard curve of petroleum hydrocarbon

2.4 方法回收率和精密度

以帶魚(yú)和鯧魚(yú)樣品作為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)在熒光條件Ex/Em=310/360 nm 下做2 組加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，扣除背景值計(jì)算回收率。每組4 個(gè)石油類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)水平分別是2.0、5.0、10、20 mg·kg-1，準(zhǔn)確稱(chēng)取帶魚(yú)樣品和鯧魚(yú)樣品各2.0 g，每個(gè)水平做6 個(gè)平行，測(cè)定石油烴含量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算結(jié)果如表3 所示，方法回收率為80%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.0%，數(shù)據(jù)表明實(shí)驗(yàn)方法有較高的回收率和精密度。

表3 樣品中添加回收率及方法的精密度試驗(yàn)(n=6)Tab.3 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=6)

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

使用該方法對(duì)來(lái)自舟山市普陀區(qū)、嵊泗縣、岱山縣、定海區(qū)捕撈漁船和漁獲運(yùn)輸船共99 批次海捕魚(yú)進(jìn)行測(cè)定，其中鯧魚(yú)樣品15 批次，占比15%；帶魚(yú)樣品26 批次，占比26%；鰻魚(yú)樣品22 批次，占比22%；小黃魚(yú)樣品11 批次，占比11%；鲅魚(yú)樣品9批次，占比9%；其他魚(yú)類(lèi)樣品16 批次，占比16%。海捕魚(yú)樣品種類(lèi)分布比例如圖5。

圖5 海捕魚(yú)種類(lèi)分布比例圖Fig.5 The proportion of sea fishes species

分析測(cè)定結(jié)果顯示各相關(guān)海捕魚(yú)樣品中石油烴的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知:石油烴檢出率為90.9%，檢出值在1.1～20 mg·kg-1，且部分樣品檢出值較高。其他海捕魚(yú)樣品中，1 份舌鰨樣品和1 份白姑魚(yú)未檢出，鮐魚(yú)含量最高為9.4 mg·kg-1。舟山港口及船舶工業(yè)發(fā)達(dá)，同時(shí)受2018 年年初“桑吉”輪沉船事故影響，給舟山海域水產(chǎn)品帶來(lái)較大的石油烴污染風(fēng)險(xiǎn)。

表4 部分海捕魚(yú)中石油烴的含量Tab.4 The amount of petroleum hydrocarbon in different sea fishes

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光分光光度法測(cè)定海捕魚(yú)肌肉組織中石油烴含量進(jìn)行了研究，主要對(duì)操作過(guò)程中皂化條件以及儀器測(cè)定時(shí)熒光光譜條件的選擇做了改進(jìn)。現(xiàn)行的《GB 17378.6-2007 國(guó)家海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范(第六部分:生物體分析)》作為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其關(guān)于生物體中石油烴的測(cè)定更加側(cè)重于海洋環(huán)境的監(jiān)測(cè)，通過(guò)監(jiān)測(cè)海洋生物體石油烴的含量來(lái)評(píng)判海洋環(huán)境現(xiàn)狀。尋求更加適合水產(chǎn)品質(zhì)量安全管理方面的測(cè)定海捕魚(yú)中石油烴的方法，為以后建立測(cè)定水產(chǎn)品中石油烴的標(biāo)準(zhǔn)做出一點(diǎn)探索。利用三維相關(guān)光譜技術(shù)分析了海捕魚(yú)中石油烴檢測(cè)的熒光條件，Ex/Em=230/340 nm 及Ex/Em=270/314 nm 時(shí)熒光強(qiáng)度高，回收率偏高；Ex/Em=310/360 nm 時(shí)熒光強(qiáng)度偏低，但回收率能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求。Ex/Em=310/360 nm 時(shí)熒光強(qiáng)度偏低，但回收率能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求。

在測(cè)定海捕魚(yú)中石油烴含量的實(shí)驗(yàn)中，注意皂化反應(yīng)必須進(jìn)行徹底，不能使用凡士林涂抹分液漏斗，旋蒸時(shí)需控制轉(zhuǎn)速以保證不產(chǎn)生暴沸，不能使用封口膜對(duì)旋蒸瓶進(jìn)行封口，復(fù)溶樣品須靜置沉淀后取上清液進(jìn)行測(cè)定。此方法中試劑干擾小，測(cè)定結(jié)果能反映真實(shí)情況，具有較好的重現(xiàn)性和較高的精密度，更加適用于海捕魚(yú)樣品中石油烴的批量檢測(cè)。