楊凌杰，胡永東，張雷芳，聞?wù)?/p>

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022)

活性氧包括過氧化氫、超氧陰離子自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧等，自由基過多便引起細(xì)胞大分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的氧化損傷[1]。細(xì)胞內(nèi)活性氧的過量產(chǎn)生，并超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的狀態(tài)被稱為氧化應(yīng)激[2]。在多種人類疾病的發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激可能起著重要作用，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、衰老、肥胖、腎病和癌癥[3]。越來越多的證據(jù)表明，抗氧化劑可以預(yù)防或抑制活性氧引發(fā)的細(xì)胞凋亡，并可能在治療因活性氧誘導(dǎo)的疾病中發(fā)揮重大作用[4]。由于消費(fèi)者對天然成分的偏好和對合成抗氧化劑的毒性作用的擔(dān)憂，用天然來源的抗氧化劑受到了人們的關(guān)注。近年來，具有清除過量自由基能力、防止細(xì)胞氧化損傷的天然活性物質(zhì)受到了人們的重視，并開展了各項研究[5-7]。

銅藻Sargassum horneri 又稱柱囊馬尾藻、海柳麥、草茜，是熱帶和亞熱帶水域最顯著的褐藻，產(chǎn)于太平洋沿岸及鄰近臺灣、中國、韓國和日本海域[8]。在東亞，銅藻被用作礦物質(zhì)、膳食纖維和維生素的豐富來源，成為了受人們關(guān)注的多功能保健食品[9]。研究表明銅藻含苯萜類化合物、褐藻糖苷類化合物、甾醇類化合物和糖脂類化合物等，銅藻提取物或分離的純成分具有廣泛的藥理活性[10]。巖藻黃質(zhì)是褐藻等中含有的天然色素，是一種對人類十分有利的活性物質(zhì)，包括抗炎、抗腫瘤、抗氧化等，日本等國家早已實際應(yīng)用它，我國對巖藻黃質(zhì)的研究還不夠深入，可以再深入地驗證其活性及其機(jī)理。NOMURA,et al[11]發(fā)現(xiàn)銅藻巖藻黃質(zhì)含量存在季節(jié)性變化，在10 月和11 月呈上升趨勢，到1 月達(dá)到最大值，之后慢慢下降。結(jié)果表明，在冬至春季采收的銅藻中巖藻黃質(zhì)含量較高。HEO,et al[12]從馬尾藻中分離得到巖藻黃質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷有較強(qiáng)的抑制作用，且具有劑量依賴性，并通過Hoechst 染色證實這一結(jié)果。這些結(jié)果表明，馬尾藻巖藻黃質(zhì)可能成為一種治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的藥物。目前，銅藻巖藻黃質(zhì)的研究較多集中于含量分析、提取、純化等階段，而細(xì)胞水平的研究較少。

巨噬細(xì)胞對宿主防御系統(tǒng)中微生物病原體的識別和消滅至關(guān)重要，是促氧化劑作用的主要目標(biāo)[13]。因此，RAW264.7 細(xì)胞系是篩選抗氧化藥物的理想模型[14]。本實驗通過建立雙氧水刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型，以評價銅藻巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為開發(fā)銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)防氧化損傷相關(guān)藥物和功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

銅藻:于舟山嵊泗島采得，由浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院鑒定，洗凈外部泥沙，在陰暗處晾干后粉碎，經(jīng)80 目過篩，避光儲存；RAW264.7 巨噬細(xì)胞；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清:美國Gibco 公司；雙抗:北京方程生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、一氧化氮(NO)檢測試劑盒:南京建成生物工程研究有限公司；噻唑藍(lán)(MTT):美國Sigma 公司；DMSO、PBS 緩沖溶液:杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鞏義市宇華儀器有限責(zé)任公司；冷凍干燥機(jī)LGJ-10D:北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；902 型超低溫冰箱、311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱:賽默飛世爾科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀:美國伯騰儀器有限公司；電子分析天平:梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；超凈工作臺SW-CJ-2F:蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī):湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Leica 倒置熒光顯微鏡:美國Leica Microsystems。

1.2 方法

1.2.1 銅藻巖藻黃質(zhì)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取20 g 銅藻粉末，按液料比1：50 的比例加入70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在溫度70 ℃，超聲功率為180 W、超聲頻率為40 kHz 的條件下避光提取50 min。在上清液中加入1 L 的石油醚，充分振搖后靜止分層，將下層有機(jī)試劑棄去。最后加入1 L 的甲醇溶液，振搖后靜止分層，將下層甲醇溶液收集起來。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸去甲醇溶液后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.9 mg 巖藻黃質(zhì)溶于3 mL 二甲基亞砜，密封放置于4 ℃環(huán)境備用，配置成5 μmol·mL-1巖藻黃質(zhì)溶液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基后，在含DMEM 培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中接種復(fù)蘇后的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，放置于無菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中溫度為37 ℃、CO2含量為5%。對細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀察記錄，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長到80%左右時，以1：4 的比例傳代，并根據(jù)細(xì)胞的生長速率判斷培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分是否充足，及時更換培養(yǎng)液。

1.2.3 建立雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷模型

將RAW264.7 巨噬細(xì)胞以104個·mL-1接種于5 塊96 孔板，各孔均加入100 μL，放入培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。觀察細(xì)胞是否處于貼壁狀態(tài)，貼壁后將上清液棄去，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，加入100 μL 由DMEM 完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的H2O2溶液，H2O2終濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·mL-1，每個濃度設(shè)6 個平行。培養(yǎng)時間分別為0、4、8、12、24 h。加20 μL 質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT 溶液于每個孔，培養(yǎng)4 h 后，1 000 r·min-1離心5 min，棄掉孔板液體，最后每孔加入150 μL DMSO，放于恒溫振板儀上振蕩15 min，用酶標(biāo)儀測定570 nm 波長下的OD 值，細(xì)胞存活率計算參照公式（1）。

式中:CSR 為細(xì)胞存活率，%；A1為空白組的平均吸光度，nm；A2為樣品組的平均吸光度，nm。

1.2.4 銅藻巖藻黃質(zhì)濃度的篩選

細(xì)胞培養(yǎng)過程均和1.2.3 節(jié)一致，將1.2.3 節(jié)所加入的DMEM 完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的H2O2換成同培養(yǎng)基配制的不同濃度銅藻巖藻黃質(zhì)溶液，銅藻巖藻黃質(zhì)終濃度分別為0、5、10、15、20、25 mmol·L-1。根據(jù)公式(1)計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 氧化損傷模型細(xì)胞下銅藻巖藻黃質(zhì)濃度的篩選

將RAW264.7 細(xì)胞以104個·mL-1接種于1 塊96 孔板，各孔均加入100 μL，放入培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。觀察細(xì)胞是否處于貼壁狀態(tài)，貼壁后將上清液棄去，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，加入100 μL 由DMEM 完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)溶液，銅藻巖藻黃質(zhì)終濃度為0(空白組)、0(雙氧水對照組)、1、5、10、12.5、15、20、25 μmol·L-1，每個濃度設(shè)6 個平行，培養(yǎng)24 h。去掉培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，加入100 μL 由DMEM 完全培養(yǎng)基配制的0.5 mmol·mL-1的H2O2溶液(第一個濃度不加)。再培養(yǎng)12 h。加20 μL 濃度為5 mg·mL-1的MTT 溶液于每個孔，培養(yǎng)4 h，1 000 r·min-1離心5 min，棄掉孔板液體，最后每孔加入150 μL DMSO，放于恒溫震板儀上震蕩15 min，記錄各組570 nm 處吸光度，根據(jù)公式（1）計算細(xì)胞存活率。

1.2.6 巖藻黃質(zhì)對雙氧水誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

將RAW264.7 細(xì)胞以4×105個·mL-1接種于3 塊96 孔板，各孔均加入106個細(xì)胞，放入培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2含量為5 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。觀察細(xì)胞是否處于貼壁狀態(tài)，貼壁后將上清液棄去，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，空白組和雙氧水陰性對照組加入完全培養(yǎng)基，銅藻巖藻黃質(zhì)處理組加入DMEM 完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)溶液，VC 組加入由DMEM 完全培養(yǎng)基配制的20 μmol·L-1抗壞血酸溶液。每個濃度設(shè)置3 個平行，培養(yǎng)24 h，去掉培養(yǎng)液，PBS 洗滌，加入終濃度0.5 mmol·L-1的雙氧水溶液。培養(yǎng)12 h，LDH、NO 釋放量通過吸取細(xì)胞上部培養(yǎng)液測定。SOD、GSH-Px 的含量通過裂解細(xì)胞后測定，操作方法都按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均使用Prism 8 繪圖統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行畫圖以及統(tǒng)計分析，分析時使用單因素方差分析以及Tukey 檢驗進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型

雙氧水可以迅速穿透細(xì)胞膜，引起氧化應(yīng)激。在研究巨噬細(xì)胞的凋亡或氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷時通常會使用雙氧水[15-16]。細(xì)胞存活率是反應(yīng)外部環(huán)境對細(xì)胞氧化損傷最直接的指標(biāo)[17]，通過MTT 法測定細(xì)胞存活率。由圖1，圖2 可知，與空白組相比，隨著雙氧水濃度的提高和雙氧水作用時間的增長，細(xì)胞存活率下降。故雙氧水細(xì)胞氧化損傷模型的建立采用具有顯著差異的0.5 mmol·L-1濃度和12 h 作用時間。

圖1 不同濃度H2O2 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide on the proliferation of RAW264.7 cell

圖2 H2O2 時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig2 Effect of the different time of hydrogen peroxide on the proliferation of RAW264.7 cells

2.2 銅藻巖藻黃質(zhì)濃度的篩選結(jié)果

評估不同濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 巨噬細(xì)胞的毒性，將銅藻巖藻黃質(zhì)(5～25 μmol·L-1)預(yù)處理RAW264.7 巨噬細(xì)胞24 h，計算存活率。由圖3 可知，與空白組對比，銅藻巖藻黃質(zhì)濃度在5～25 μmol·L-1范圍時，對細(xì)胞增殖均無顯著影響(P>0.05)，說明該濃度銅藻巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 巨噬細(xì)胞無殺傷力，可以進(jìn)行下一步實驗。

圖3 不同濃度巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of fucoxanthin on the proliferation of RAW264.7 cells

2.3 銅藻巖藻黃質(zhì)對氧化損傷RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響

之前實驗已確定H2O2為0.5 mmol·L-1濃度和12 h作用時間可建立RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型。因此，本實驗中選用不同濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)探究其對氧化損傷RAW264.7 巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用。如圖4可知，與空白組相比，(1～15 μmol·L-1)濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)處理組和H2O2陰性對照組的細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)，說明氧化損傷模型建立成功。高濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)處理后，RAW264.7 巨噬細(xì)胞的存活率隨著銅藻巖藻黃質(zhì)濃度的增加而提高。結(jié)果表示，25 μmol·L-1濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)組細(xì)胞存活率與空白組無顯著差異(P>0.05)，說明銅藻巖藻黃質(zhì)對H2O2造成的細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用。后續(xù)實驗將選用15、20、25 μmol·L-13 個濃度。

圖4 巖藻黃-質(zhì)對H2O2 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of fucoxanthin treatment on H2O2-induced RAW264.7 cell viability

2.4 銅藻巖藻黃質(zhì)對氧化損傷RAW264.7 細(xì)胞SOD 活力的影響

抗氧化酶SOD 在宿主細(xì)胞因超氧陰離子引發(fā)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，機(jī)理是通過歧化反應(yīng)催化超氧陰離子分解[18-19]。SOD 活力的上調(diào)與抵抗各種非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激有關(guān)[20]。由圖5 可知，和空白組相比，H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)SOD 活力顯著降低(P＜0.05)。用不同濃度銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞的SOD 活力顯著升高(P＜0.05)。銅藻巖藻黃質(zhì)濃度為20、25 μmol·L-1時SOD 活力和VC 陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖5 巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞中SOD 活性的影響Fig.5 Effects of fucoxanthin on SOD activity in RAW264.7 cells

2.5 銅藻巖藻黃質(zhì)對氧化損傷RAW264.7 細(xì)胞GSH-Px 含量的影響

GSH-Px 是機(jī)體中廣泛存在的過氧化酶[21]，將H2O2分解成H2O 和氧分子[22]。圖6 顯示了銅藻巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞GSH-Px 含量的影響。結(jié)果表明，H2O2組顯著降低細(xì)胞中GSH-Px 活力。而20、25 μmol·L-1濃度的銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)培養(yǎng)24 h 后，均可以顯著提高GSH-Px 活力(P＜0.05)，在15 μmol·L-1濃度時沒有顯著提高。

圖6 巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞中GSH-Px 活性的影響Fig.6 Effects of fucoxanthin on GSH-Px activity in RAW264.7 cells

2.6 銅藻巖藻黃質(zhì)對氧化損傷RAW264.7 細(xì)胞LDH 活力的影響

通過測定氧化損傷細(xì)胞的釋放的LDH 活力，用來評價H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和質(zhì)膜損傷[23]。由圖7 可知，與空白組相比，H2O2組LDH 釋放量顯著升高(P＜0.05)。然而，銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)培養(yǎng)24 h 后，使LDH 釋放量呈濃度依賴性降低。并且和VC 陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖7 巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞中LDH 活力的影響Fig.7 Effects of fucoxanthin on LDH activity in RAW264.7 cells

2.7 銅藻巖藻黃質(zhì)對氧化損傷RAW264.7 細(xì)胞NO 活力的影響

NO 是具有多種生物學(xué)功能的重要調(diào)控和效應(yīng)分子，過多的NO 生成會深刻影響機(jī)體的細(xì)胞[24]。由圖8可知，H2O2誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞損傷后，NO 釋放量顯著升高(P＜0.05)。而銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)培養(yǎng)24 h 后，可抑制H2O2誘導(dǎo)引起的NO 釋放量增高，并呈劑量依賴性。銅藻巖藻黃質(zhì)濃度為25 μmol·L-1時，NO 釋放量與VC 陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖8 巖藻黃質(zhì)對RAW264.7 細(xì)胞中NO 活力的影響Fig.8 Effects of fucoxanthin on NO activity in RAW264.7 cells

3 討論和總結(jié)

巨噬細(xì)胞對宿主防御系統(tǒng)中微生物病原體的識別和消滅至關(guān)重要，是促氧化劑作用的主要目標(biāo)。因此，RAW264.7 細(xì)胞系是篩選抗氧化藥物的理想模型。H2O2是一種常見的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可通過直接氧化生物分子(脂類、蛋白質(zhì)、DNA)而損傷細(xì)胞，或作為信號分子觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。本實驗證實了0.5 mmol·L-1H2O2和12 h 作用時間可使RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷。采用MTT 法檢測FU 對RAW264.7 細(xì)胞的毒性，并研究在氧化損傷前銅藻FU 是否可以起到細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果顯示，銅藻巖藻黃質(zhì)(5～25 μmol·L-1)在RAW264.7 細(xì)胞無毒性，并且以劑量依賴的方式提高了H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的存活率。結(jié)果說明銅藻巖藻黃質(zhì)對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

H2O2引起的細(xì)胞氧化與H2O2攻擊抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的增加，降低酶活性和細(xì)胞膜的通透性[26-28]。SOD 和GSH-Px 是主要的抗氧化酶，可以清除自由基，維持氧化劑和抗氧化劑之間的平衡，是抗氧化損傷的第一道防線[28]。通常來說，當(dāng)這些抗氧化酶的活性占優(yōu)勢時，ROS-抗氧化平衡和膜的完整性得以維持[29]。因此，我們通過測定抗氧化酶的活性來評估銅藻巖藻黃質(zhì)對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷后，SOD 和GSH-Px 顯著降低，說明抗氧化酶防御系統(tǒng)受損。然而，當(dāng)銅藻巖藻黃質(zhì)預(yù)培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞24 h 后，阻止了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力降低。并且25 μmol·L-1銅藻巖藻黃質(zhì)和20 μmol·L-1VC 對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷具有相似的保護(hù)作用。這些結(jié)果表明銅藻巖藻黃質(zhì)可能是通過提高H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的抗氧化酶活性來減輕氧化損傷。

LDH 釋放量通常被用作衡量細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)[30]。NO 在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮重大作用[31]。NO 本身是一種自由基，能與O2-反應(yīng)生成氧化亞硝基陰離子(ONOO-)，并在OH-、NO2上分解，對細(xì)胞產(chǎn)生急性毒性損傷[32]。本實驗發(fā)現(xiàn)，銅藻巖藻黃質(zhì)可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的LDH 釋放量和NO 含量。說明銅藻巖藻黃質(zhì)可能是通過降低LDH 和NO 的釋放量來緩解H2O2對RAW264.7 細(xì)胞的損傷。

綜上所述，銅藻巖藻黃質(zhì)可以通過提高細(xì)胞中SOD 和GSH-Px 的活性，降低細(xì)胞內(nèi)LDH 和NO 的釋放，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷。