邱瑋茜，王 帥，鞠 青，薛 頌

(1.山東省青島生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心分析室，山東青島 266003；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東青島 266003)

生長調(diào)控因子(growth-regulating factor,GRF)對植物的生長發(fā)育起重要的調(diào)控作用，是植物中特殊存在的一類轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。GRF 基因家族在其編碼蛋白序列的N 末端區(qū)域具有2 個保守結(jié)構(gòu)域，分別為QLQ(Gln，Leu，Gln)結(jié)構(gòu)域和WRC(Trp，Arg，Cys)結(jié)構(gòu)域。其中，QLQ 結(jié)構(gòu)域能夠與生長調(diào)控作用因子(GIF)相互作用，由此產(chǎn)生的化合物可作為轉(zhuǎn)錄激活因子[3]。WRC 結(jié)構(gòu)域由一個核定位信號域(NLS)和一個鋅指結(jié)構(gòu)組成[4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR396 調(diào)控GRFs 的表達，而GRFs 是miR396 的主要靶標[5]，miR396-GRF/GIF 基因網(wǎng)絡(luò)是影響植物生長的重要中樞，通過內(nèi)源性和環(huán)境信號協(xié)調(diào)各種生長和生理反應(yīng)[6-7]，參與葉片的發(fā)育[8]、開花[9]、種子和根的生長[10]、植株器官壽命的調(diào)節(jié)[11]等，GRF 基因家族還與植物滲透脅迫能力有關(guān)[12-14]。近年來，圍繞植物GRF 基因家族的研究較多，但上述研究主要集中于陸生高等植物中，在海洋植物中卻鮮有報道。

鰻草Zostera marina 作為海草中的一員，隸屬于被子植物門、單子葉植物綱，鰻草科，鰻草屬Zostera[15]，在我國主要分布于遼寧至山東沿海[16]，在俄羅斯、日本以及北美洲地區(qū)也有分布[17-18]，其耐鹽脅迫能力強，可以生活在含鹽量高達35 的海水中[15]。作為海洋高等被子植物，鰻草在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著非常重要的角色，不僅是魚類和其他物種的食物來源，也是許多生物種群的棲息地。此外，鰻草在生態(tài)學中具有非常重要的地位，它可以固定水體沉積物，過濾雜質(zhì)，凈化水質(zhì)，減少海岸侵蝕。鰻草在淺海區(qū)會形成一定規(guī)模的海草床，在近海生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)地位，為需要的海洋生物提供食物，是許多海洋生物的天然棲息場所。在進化過程中，鰻草至少經(jīng)歷3 次并行演化，由陸地環(huán)境轉(zhuǎn)而適應(yīng)海洋環(huán)境[19]，并進化出多種形態(tài)和生理功能，從而能夠適應(yīng)海水的高滲、低光強和異于陸生植物的光譜。

鰻草屬潮間帶和潮下帶的多年生沉水植物，潮間帶是海洋環(huán)境和陸地環(huán)境的過渡帶，也是地球上最具環(huán)境壓力的區(qū)域之一，在此生長的鰻草由于長期受到海陸環(huán)境的雙重作用和交互影響，勢必蘊涵著復(fù)雜多樣的適應(yīng)機制與進化信息。OLSEN，et al[20]基于鰻草基因組的研究發(fā)現(xiàn)，鰻草在進化過程中已經(jīng)丟失了陸生被子植物普遍存在的調(diào)控氣孔開放、萜類化合物合成和紫外線感受基因以適應(yīng)特殊的海洋環(huán)境，同時獲得了一些可調(diào)控細胞離子穩(wěn)定、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和氣體交換等基因，以實現(xiàn)對高鹽和高滲透壓海水環(huán)境的適應(yīng)。以上研究為解析鰻草對海洋環(huán)境的適應(yīng)性機制提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)來源。本研究基于已公布的鰻草基因組數(shù)據(jù)選擇調(diào)控植物的生長發(fā)育、滲透脅迫的重要基因家族—GRF 基因家族，對鰻草GRF 家族進行鑒定與生物信息學分析，以期為鰻草GRF 基因家族功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 鰻草GRF 基因家族成員鑒定和特征分析

鰻草的基因組序列、編碼蛋白氨基酸序列和cDNA 序列來源于phytozome v12.1 數(shù)據(jù)庫(https：//phytozome.jgi.doe.gov)。下載基因組相關(guān)數(shù)據(jù)后，基于本地BLAST 構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫。以擬南芥Arabidopsis thaliana 和大豆Glycine max 的GRF 家族的氨基酸作為種子序列，搜索鰻草基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，篩選獲取e 值小于-20 的序列作為鰻草GRF 候選基因。為更好確定獲取基因的準確性，本研究結(jié)合Pfam 蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)中GRF 家族的WRC(PF08879)結(jié)構(gòu)域和QLQ(PF08880)結(jié)構(gòu)域，利用HMMER 軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，并以此作為種子序列搜索鰻草蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲取鰻草GRF 基因家族的候選基因。綜合2 種篩選方式所獲取基因，利用SMART 在線軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對候選基因進行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定。鰻草GRF 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由ExPasy(https：//web.expasy.org/protparam/)進行分析。

1.2 鰻草GRF 基因家族結(jié)構(gòu)和蛋白保守序列分析

本研究中，使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)GSDS 2.0(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)[21]繪制鰻草GRF 基因家族的基因結(jié)構(gòu)示意圖。同時，使用MEME 在線軟件(http：//meme-suite.org/doc/download.html)對所篩選的鰻草GRF蛋白的保守基序進行分析[22]，基序搜索數(shù)目為5，其他參數(shù)為默認設(shè)置。

1.3 鰻草GRF 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究鰻草GRF 基因家族的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，本研究采用MEGA 6.0 軟件，利用鄰接法構(gòu)建鰻草與擬南芥、大豆和二穗短柄草Brachypodium distachyum 3 個物種的GRF 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢值設(shè)置為1 000。

1.4 鰻草GRF 基因家族成員啟動子區(qū)順式作用元件分析

從鰻草基因組數(shù)據(jù)庫中獲取鰻草GRF 基因家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 500 bp 序列，并利用Plant-CARE 在線數(shù)據(jù)[23]對啟動子區(qū)的順式作用元件進行分析。

1.5 鰻草GRF 基因家族的表達分析

為了分析鰻草GRF 基因家族的組織表達特異性，本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)中獲得不同組織器官的FPKM 值(SRX978554-SRX978576)[20]，利用TBtool 軟件的Heatmap 功能繪制基因表達熱圖[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻草ZmGRF 基因鑒定及蛋白基本信息分析

本研究基于鰻草基因組數(shù)據(jù)，利用blast 和HMMER 初步共鑒定出了10 個鰻草GRF 家族成員，經(jīng)過SMART 功能結(jié)構(gòu)域的鑒定，最終確定了10 個鰻草GRF 編碼基因，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分別命名為Zm-GRF1～ZmGRF10。通過對鰻草GRF 蛋白質(zhì)進行基本性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，ZmGRF1 氨基酸數(shù)目最少為242 個，ZmGRF8 最多為552 個，通過ExPASy 軟件對鰻草GRF 蛋白質(zhì)序列進行分析，10 個GRF 蛋白的分子量大小范圍26 984.31～60 266.97 Da，等電點為7.61～9.13，親水性平均系數(shù)為-0.907～-0.611，10 個GRF 蛋白均定位在細胞核。預(yù)測結(jié)果表明，鰻草GRF 蛋白均為堿性蛋白，且序列差異較大(表1)。

表1 鰻草GRF 蛋白信息分析Tab.1 Basic information analysis of GRF protein in Z.marina

2.2 鰻草ZmGRF 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用Mega 6.0 軟件，將鰻草ZmGRF 家族蛋白序列與擬南芥、大豆和二穗短柄草的GRF家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示，所有的GRF 蛋白分成了6 個亞家族，并且每個亞家族成員數(shù)目不等。鰻草GRF 亞家族分散到5 個亞家族中，在各個亞家族分布不均勻，亞家族1 有2個成員，亞家族2 有3 個成員，亞家族3 有1 個成員，亞家族4 有2 個成員，亞家族5 有2 個成員(圖1)。

圖1 鰻草GRF 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of GRF gene family in Z.marina

2.3 鰻草GRF 基因結(jié)構(gòu)分析

鰻草GRF 基因的結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，外顯子數(shù)目存在差異(圖2)，數(shù)目最少的是ZmGRF7 僅為1個，數(shù)目最多的是ZmGRF8 和ZmGRF9 為4 個。鰻草ZmGRF 基因家族進化樹中親緣關(guān)系較近的外顯子數(shù)目較為接近，例如ZmGRF3、ZmGRF4 和Zm-GRF5 外顯子數(shù)目均為3 個；ZmGRF1 和ZmGRF2 均為2 個。保守基序信息圖表明(圖3)，鰻草ZmGRF 基因家族蛋白均包含3 個保守基序，且基序1、基序2 和基序3 中的氨基酸表現(xiàn)出高度保守(圖3)。

圖2 鰻草GRF 基因家族成員的結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure of ZmGRF in Z.marina

圖3 鰻草GRF 蛋白保守基序分析Fig.3 Protein conserved motif analysis of ZmGRF family in Z.marina

2.4 鰻草GRF 基因啟動子區(qū)分析

為更好地了解順式作用元件對基因的調(diào)控作用，選取鰻草GRF 基因家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 500 bp序列，利用在Plant-CARE 在線工具對順式作用元件進行分析。結(jié)果顯示，10 個ZmGRF 基因均含有多個TATA 盒和CAAT 盒，表明ZmGRF 家族基因均能正常進行轉(zhuǎn)錄。由于GRF 基因家族主要參與生長調(diào)控，因此我們對ZmGRF 基因啟動子中與鰻草生長發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件進行分析。由表2 可知，ZmGRF 基因啟動子中均含有大量的順式調(diào)控元件，與鰻草生長調(diào)控相關(guān)的主要有胚乳表達調(diào)控(GCN4-motif)、玉米醇蛋白代謝調(diào)節(jié)(O2-site)等順式作用元件。此外，在ZmGRF 家族啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了許多脅迫與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，主要包括生長素(AuxRR-core、TC-rich repeats、TGA-element 等)、脫落酸(ABRE)、水楊酸(TCA-element)等激素響應(yīng)元件，以及厭氧誘導(ARE)、光感(Box4、MRE、G-box 等)、干旱(MBS)等脅迫響應(yīng)順式作用元件。

表2 鰻草GRF 基因家族啟動子區(qū)分析Tab.2 Analysis of promoter region of GRF gene family of Z.marina

2.5 鰻草GRF 基因表達分析

為了進一步探究ZmGRF 基因家族在鰻草生長和發(fā)育中的作用，我們從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載5 種鰻草組織器官的轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)(FPKM 值)，用以分析其表達模式，分別包括鰻草雄花開花前(Female_flower_early)、雄花開花后(Female_flower_late)、雌花(Male_flower)、根系(Root)和營養(yǎng)器官(Vegetative)。結(jié)果顯示(圖4)，鰻草ZmGRF 在不同器官中存在差異表達，呈現(xiàn)出明顯的組織表達特異性，根系中ZmGRF1、ZmGRF3、ZmGRF5 和ZmGRF7表達量較高，ZmGRF2、ZmGRF4、ZmGRF6 和ZmGRF8 在雄花中表達量較低；鰻草雄花開花前后存在ZmGRF 差異表達，Zm-GRF1、ZmGRF4、ZmGRF5 和ZmGRF10 在雄花開花后顯著高于開花前，其余ZmGRF 表達差異不明顯；同一ZmGRF 基因在不同器官中也存在明顯的表達差異。

圖4 鰻草ZmGRF 家族不同組織的表達分析Fig.4 Expression analysis of different tissues of ZmGRF gene family of Z.marina

3 討論

GRFs 是植物特異性基因家族的成員，在植物生長發(fā)育中起著重要的作用，尤其是在調(diào)節(jié)器官大小方面[2,25]。到目前為止，GRF 家族已在許多植物中得到鑒定。例如模式植物擬南芥[4]、水稻Oryza sativa[26]、番茄Lycopersicon esculentum[27]、桃Prunus persica[28]、茶樹Camellia sinensis[29]、甜橙Citrus sinensis[30]、歐洲油菜Brassica napus[31]、大豆[32]等物種。然而，上述研究主要集中于陸生高等植物中，關(guān)于海洋植物，尤其是適應(yīng)海洋環(huán)境的高等植物，卻鮮有報道。為了更好地了解ZmGRFs 的特性和功能，我們對鰻草ZmGRF 家族進行生物信息學分析。本研究在鰻草基因組中共鑒定了10 個GRF 蛋白，與擬南芥(9 個GRFs) 和水稻(11 個GRFs) 數(shù)目類似，鰻草ZmGRF 家族成員蛋白序列具有完整的功能結(jié)構(gòu)域QLQ 和WRC。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，10 個ZmGRFs 根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可分為5 個亞家族，通過與其他植物GRF家族的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，GRF 家族成員可分成6 組，不同物種的亞家族組成不同，這可能是由于植物基因擴增和進化模式的不同造成的[33]。鰻草ZmGRF 基因結(jié)構(gòu)和基序分析與系統(tǒng)發(fā)育分析一致，不同亞群的ZmGRF 的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較低的一致性。

大量研究表明，基因復(fù)制不僅可以增加GRF 的數(shù)量，而且是產(chǎn)生新基因的途徑，有利于植物適應(yīng)各種環(huán)境[32,34-35]。物種中基因數(shù)目的增加來自基因組復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和大規(guī)模的片段復(fù)制，GRF 基因家族來自大規(guī)模的片段復(fù)制。所有物種中GRF 蛋白的數(shù)目存在一定的差異性。基因數(shù)目增加造成基因功能的冗余，使植物能更好地適應(yīng)環(huán)境的變化。本研究中，鰻草GRF 亞家族分散到5 個亞家族中，亞家族2 有3 個成員，亞家族3 有1 個成員，亞家族4 有2 個成員，亞家族5 有2 個成員，推測在ZmGRF 家族的擴展過程中，存在基因復(fù)制情況。

光不僅為植物提供能量，而且調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[36-37]。植物可以通過光感受器系統(tǒng)感知光環(huán)境的變化。本研究中，在鰻草ZmGRF 啟動子區(qū)篩選獲得許多光感順式作用元件(Box4、MRE、G-box 等)，我們推測鰻草ZmGRF 的表達受到了光照的調(diào)控。此外，在ZmGRF 家族啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量的響應(yīng)激素和脅迫相關(guān)順式元件，推測鰻草ZmGRF 參與鰻草的生長發(fā)育，并且能夠調(diào)控多種激素響應(yīng)和抗逆反應(yīng)。

已有研究報道GRFs 是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2,6]。一般情況下，生長活躍組織中GRFs 的表達水平高于成熟組織[38]。一些研究表明，隨著器官的衰老，GRFs 的轉(zhuǎn)錄水平下降[29]。本研究中，ZmGRF 存在組織表達差異，同一基因在不同組織中存在表達差異，不同基因在同一組織中也存在表達差異。此外，鰻草雄花開花前后ZmGRF 存在明顯的差異表達，在花的發(fā)育過程中存在高表達，提示這些基因可能在雄花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，推測除了調(diào)控種子的發(fā)育，GRFs 在花的發(fā)育中也很重要[30]，例如參與鰻草雄花的發(fā)育調(diào)控。

4 總結(jié)

本研究在鰻草全基因組范圍內(nèi)對ZmGRF 基因家族進行鑒定，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示將10 個基因分為5組；順式元件分析結(jié)果顯示ZmGRFs 可能調(diào)控多種激素響應(yīng)和抗逆反應(yīng)，并參與鰻草生長發(fā)育調(diào)節(jié)；Zm-GRF 存在組織表達差異，并可能參與鰻草雄花的發(fā)育調(diào)控。