楊金月，劉 璐，何治江，何夢嵐，郝明梅，張曉林，嚴小軍，廖 智

(浙江海洋大學海洋科學與技術(shù)學院，海洋生物功能蛋白與活性多肽研究室，浙江舟山 316022)

抗菌肽是當前生物活性多肽研究的重要領(lǐng)域，也是新型生物抗生素開發(fā)的先導分子，在醫(yī)學和藥學等方面具有重要的研究和應(yīng)用價值[1]。貽貝抗菌肽因其抗菌活性強，分子多樣性豐富而成為海洋生物抗菌肽研究的重要物種[2]。目前已從貽貝體內(nèi)鑒定到的抗菌肽家族至少有9 種，包括在蛋白層面鑒定到的mytilin[3]、myticin[4]、mytimycin[5]和defensin[6]4 類經(jīng)典貽貝抗菌肽家族，以及在基因?qū)用骅b定的big defensin、mytimacin[7]和myticalin[8]；此外，我們在前期研究中從厚殼貽貝Mytilus coruscus 血清中鑒定到myticusin-1[9]和mytichitin[10]。上述抗菌肽的發(fā)現(xiàn)使得貽貝成為目前海洋生物中鑒定抗菌肽家族種類最多的物種。

Myticusin-1 是此前從厚殼貽貝血清中分離到的一種分子量較大的抗菌肽，為本實驗室首次發(fā)現(xiàn)并命名[9]。Myticusin-1 成熟肽由104 個氨基酸殘基所組成，分子量11 kDa；其序列中含有10 個半胱氨酸，形成5 對二硫鍵，是一種典型的富含二硫鍵的貽貝抗菌肽[9]。Myticusin-1 對革蘭氏陽性菌和陰性菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，但對革蘭氏陽性菌的抑菌活性比革蘭氏陰性菌要強約10 倍[9]，但其對革蘭氏陽性菌和陰性菌的免疫響應(yīng)機制仍不明確。與經(jīng)典的貽貝抗菌肽，如mytilin、myticin、defensin 等相比，myticusin-1 表現(xiàn)出較大的分子量，偏中性的等電點(pI 為6.8)，特殊的半胱氨酸分布模式，以及結(jié)構(gòu)預測中表現(xiàn)出以alpha-螺旋為主等結(jié)構(gòu)特征[9]；上述結(jié)果表明，myticusin-1 在貽貝免疫防御中具有較為特殊的結(jié)構(gòu)和功能。Myticusin-1 在貽貝體內(nèi)含量極低，同時，由于myticusin-1 分子較長且二硫鍵較多，采取固相化學合成手段具有較大困難，因此，采用原核重組表達的手段開展厚殼貽貝抗菌肽myticusin-1 的制備是開展后續(xù)研究的重要前提。此外，為進一步研究myticusin-1 在貽貝體內(nèi)的功能，采取實時熒光定量PCR 手段，對厚殼貽貝分別在金黃葡萄球菌、溶藻弧菌和白色念珠菌的誘導下，其血細胞myticusin-1 基因基因表達水平的時間變化曲線。上述研究將為深入了解貽貝myticusin-1 這一新型抗菌肽的功能以及后續(xù)的工程化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Myticusin-1 的重組表達、復性及分離純化

Myticusin-1 的cDNA 基因(GeneBank 編號JQ806765.1)編碼1 個由128 個氨基酸殘基組成的前體蛋白，包括由24 個氨基酸殘基所組成的信號肽和由104 個氨基酸殘基所組成的成熟肽區(qū)。對其成熟肽區(qū)的編碼核苷酸序列(315 bp)開展了基因密碼子優(yōu)化設(shè)計。采用OptimumGeneTM技術(shù)平臺(http：//www.genscript.com/)對目標基因的密碼子進行大腸桿菌偏愛密碼子替換，結(jié)合GC 含量、mRNA 二級結(jié)構(gòu)等因素進行了優(yōu)化設(shè)計；同時，在目標基因的5′端，添加Nco I 酶切位點(CCATGG)、保護堿基(CA)和多聚組氨酸標簽(CATCATCATCATCATCAC)；在目標基因的3′端，添加終止密碼子(TAA)和Xho I 酶切位點(CTCGAG)；最終設(shè)計出的目標基因全長為347 bp，該目標基因由南京金斯瑞公司合成。

合成后的目標基因經(jīng)測序驗證無誤后，采用Nco I 和Xho I 進行雙酶切并連接表達載體pET28a；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，經(jīng)抗性篩選和培養(yǎng)后，挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，陽性克隆送上海生工生物公司測序驗證。

將成功構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 表達菌株感受態(tài)細胞中，經(jīng)抗性篩選和培養(yǎng)，挑取單克隆菌落于相應(yīng)抗性的LB 液體培養(yǎng)基中進行2 次培養(yǎng)。培養(yǎng)后的菌液按照1：100 比例進行擴大培養(yǎng)。分別設(shè)置37 °C 和15°C 2 種培養(yǎng)溫度，以IPTG(1 mmol·L-1)進行重組表達誘導。

誘導表達后的菌液經(jīng)離心(1 000 ×g，10 min，4 ℃)，收集菌體進行冰浴超聲破碎，之后離心(8 000 ×g，15 min，4 ℃)，分別收集上清和沉淀(包涵體)。用緩沖液A(10 mmol·L-1咪唑，8 mol·L-1尿素，0.1 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1PBS，pH 8.0)溶解包涵體，之后離心(8 000 ×g，15 min，4 ℃)收集上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔膜過濾后上樣鎳柱(Ni-NTA，上海生工生物工程有限公司)。之后以緩沖液B(30 mmol·L-1咪唑，8 mol·L-1尿素，0.1 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1PBS，pH 8.0)洗柱；再以緩沖液C (300 mmol·L-1咪唑，8 mol·L-1尿素，0.1 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1PBS，pH 8.0) 洗脫目標蛋白。

經(jīng)鎳柱純化后的目標蛋白采用透析復性策略。分別配置復性液I、II 和III，其中復性液I 配方為:4 mol·L-1尿素，0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；復性液II 配方為:2 mol·L-1尿素，0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；復性液III 配方為:0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；4 °C 攪拌透析。

復性后的目標蛋白采用高效液相色譜進行進一步純化。高效液相色譜儀為Waters600 E 型(美國，Waters 公司)，檢測器為Waters 2487 雙波長紫外檢測器；色譜柱為C8 反相色譜柱(Vydac，218TP)；采用線性梯度洗脫，即B 液(含0.1%的乙腈)在30 min 內(nèi)，其比例由5%上升至60%，A 液為含0.1%的純水；流速為1 mL·min-1；檢測波長為280 nm。

1.2 SDS-PAGE 和Western Blot 分析

SDS-PAGE 采用12%分離膠，樣品事先以電泳上樣緩沖液(上海生工公司)溶解；以牛血清白蛋白(上海生工生物工程公司)作為定量分析對照，上樣量為20 μL。采用120 V 恒壓模式電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍R250 進行膠染色并觀察。

Western 印跡分析參照文獻[11]方法進行；將電泳分離后的蛋白膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。因所表達的目標蛋白含有多聚組氨酸標簽(His-tag)，因此，膜經(jīng)洗滌和封閉后，采用鼠抗His-tag 抗體(南京金斯瑞公司，貨號A00186)進行孵育過夜，之后再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(南京金斯瑞公司，貨號A00160)孵育60 min，以ECL 化學發(fā)光試劑進行顯影。

1.3 重組myticusin-1 的抑菌活性測試

參照文獻[6]，采用生長曲線抑制法結(jié)合培養(yǎng)基倍比稀釋檢測myticusin-1 的抑菌活性。細菌事先用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD630為0.01)，在96 孔板每個孔加入90 μL 菌液。重組myticusin-1 樣品預先用PBS 緩沖液(pH 7.4)溶解，重組myticusin-1 配置成水溶液并加入至96 孔板中，加樣量為10 μL/孔，蛋白終濃度分別為125、62.5、31.3、15.6、7.8 和3.9 μmol·L-1濃度梯度。以同體積PBS 緩沖液作為陰性對照。

將96 孔板在振蕩器上輕柔的振蕩使樣品和菌液充分混合，然后放入37 ℃培養(yǎng)8～12 h。采用酶標儀測定培養(yǎng)前后的每孔OD 值，以衡量多肽對于細菌生長的抑制作用。多肽的最低抑制濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]～[b]表示，其中[a]代表細菌繼續(xù)生長的最大濃度，而[b]代表細菌完全被殺滅的最低濃度。

所用的菌種為:2 種真菌:黑曲霉Aspergillus niger(ATCC16404)、白色念球菌Monilia albican(ATCC10231)；5 種革蘭氏陽性菌:藤黃疊球菌Sarcina lut ea(ATCC4698)、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(ATCC10792)、枯草芽孢桿菌B.subtilis(ATCC19659)、巨大芽孢桿菌B.megaterium(ATCC 19161)、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC25923)；7 種革蘭氏陰性菌:大腸桿菌Escherichia coli、溶藻弧菌Vibrio alginolytica (ATCC17749)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus (ATCC17802)、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa(ATCC9027)、哈維氏弧菌V.harveyi(ATCC33842)、熒光假單胞菌P.fluorescens(ATCC13525)、鰻弧菌V.anguillarum(ATCC43306)。

1.4 厚殼貽貝的采集與誘導

成年厚殼貽貝(殼長7～8 cm)采集自舟山嵊泗枸杞島海域。采集后以潔凈海水中暫養(yǎng)于恒溫(22 ℃)養(yǎng)殖池48 h。將厚殼貽貝分為對照組和誘導組。其中誘導組分別采用金黃葡萄球菌、溶藻弧菌和白色念珠菌進行后閉殼肌注射誘導(各菌種注射量為106CFU)，對照組注射采用無菌海水。誘導后分別在30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 取貽貝血細胞。

1.5 血細胞中myticusin-1 基因表達的定量分析

用TRIzo1 試劑提取貽貝血細胞總RNA。對提取RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包括:2×RT buffer 10 μL，反轉(zhuǎn)錄引物(F:GGAGGACCATTAAGTACAGCTCG，R:ATATTTCCATGACACCACAAACG)1 μL、RT-mix 1 μL、模板(RNA)5 μL、DEPC 水3 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為:25 ℃5 min，42 ℃50 min，85 ℃5 min。內(nèi)參基因為Beta-actin (F：ATGAAACCACCTACAACAGT，R：TAGACCCACCAATCCAGACG)。熒光定量PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:2× PCR buffer 25 μL、Primer F(25 pmol·μL-1)1 μL-1、Primer R(25 mol·μL-1)1 μL、Sybr green I 0.5 μL、模板(cDNA) 2 μL、DEPC 水20.5 μL。熒光定量PCR 擴增條件為:95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，35 個循環(huán)。然后用ABI 7500 SDS 軟件(Applied Biosystems)對PCR 數(shù)據(jù)進行分析，并自動設(shè)置基線以保持一致性。表達水平采用2-ΔΔCt進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用平均值±方差(mean±SD)記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3 次。利用SPSS 25.0 軟件包中one-way ANOVA 單因素方差檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 代表顯著性差異，P＜0.01 代表極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 重組myticusin-1 的表達與純化

天然myticusin-1 成熟肽區(qū)域的基因長度為315 bp，經(jīng)重新設(shè)計和優(yōu)化，目標基因長度為347 bp，設(shè)計后的目標基因編碼一條長度為112 個氨基酸殘基組成的重組蛋白(圖1A)，與天然myticusin-1 相比，重組myticusin-1 在N 端多出一段MAHHHHHH 肽段，其余序列與天然myticusin-1 一致。重新設(shè)計的目標基因與天然myticusin-1 的序列一致性為68%。對優(yōu)化后的目標基因開展了密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)分析，結(jié)果如圖1。Myticusin-1 基因在優(yōu)化前，其CAI 值經(jīng)OptimumGeneTM軟件在線計算(http：//www.genscript.com.cn/technology-support/on-line-tools)，為0.67；經(jīng)優(yōu)化后，其CAI 值達到了0.96。CAI值大于0.8 則意味著該目標基因在大腸桿菌中的表達效率較高[12-13]。

圖1 myticusin-1 基因經(jīng)優(yōu)化前后的密碼子使用偏好性分布比較圖Fig.1 The distribution of codon usage frequency along the gene sequence of myticusin-1 before and after OptimumGeneTM optimization

Myticusin-1 重組菌經(jīng)IPTG 誘導表達后，收集重組菌菌體，經(jīng)超聲破碎和離心后，上清與沉淀部分分別以SDS-PAGE 進行檢測，結(jié)果如圖2。由圖2A 可見，目標蛋白主要表達于沉淀部分，呈包涵體表達特征。目標蛋白條帶位于10 kDa 和20 kDa 之間，約為12 kDa，與重組myticusin-1 的預期分子量接近。進一步經(jīng)Western Blot 檢測，所表達的目標條帶能與抗組氨酸抗體結(jié)合并產(chǎn)生特異性亮帶，表明所表達的重組myticusin-1 帶有多聚組氨酸標簽(圖2B)。

圖2 重組myticusin-1 蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)表達的SDS-PAGE 和Western Blot 分析Fig.2 SDS-PAGE with Coomassie blue staining (A) and Western Blot(B) analysis of recombinant myticusin-1

因myticusin-1 含有10 個半胱氨酸并形成5 對二硫鍵，因此，重組表達后的myticusin-1 經(jīng)鎳柱純化采用透析復性策略，以期完成正確折疊。復性后的重組myticusin-1采用反相高效液相色譜進行分離，結(jié)果如圖3。由圖3 可見，復性后重組myticusin-1 的純度較高，可用于后續(xù)功能試驗。

圖3 復性后的重組myticusin-1 反相液相色譜分離圖Fig.3 The isolation of recombinant myticusin-1 by reverse-phase HPLC after oxidation

2.2 重組myticusin-1 的抑菌活性

重組myticusin-1 經(jīng)HPLC 純化和復性后，采用生長曲線抑制法開展抑菌活性測試。結(jié)果見表1。重組myticusin-1 對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。其中，重組myticusin-1 對革蘭陽性菌株，包括藤黃疊球菌、巨大芽孢桿菌和金黃葡萄球菌有較強抑菌活性(MIC＜20 μmol·L-1)，對蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌活性較弱；重組myticusin-1 對革蘭氏陰性菌株的抑菌活性，除哈維氏弧菌和綠膿桿菌外普遍較弱。其中，對大腸桿菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌和熒光假單胞菌的抑菌活性較弱(MIC>30 μmol·L-1)。重組myticusin-1 對真菌，包括黑曲霉和白色念珠菌也有較強的抑菌活性(MIC＜20 μmol·L-1)。

表1 重組myticusin-1 的抑菌活性Tab.1 The antimicrobial activities of recombinant myticusin-1

2.3 Myticusin-1 經(jīng)不同菌種誘導后在血細胞中的表達

分別采用金黃葡萄球菌、溶藻弧菌和白色念珠菌對貽貝進行注射誘導，利用熒光定量PCR 檢測厚殼貽貝血細胞myticusin-1 基因在誘導前后的時空表達變化，結(jié)果如圖4 所示。其中，注射金黃葡萄球菌1 h 后myticusin-1 在血細胞中的表達量較對照組有明顯上調(diào)，并在4 h 達到最大值，隨后逐漸下降并恢復至正常水平，之后在72 h 再次出現(xiàn)輕微上調(diào)；注射白色念珠菌和溶藻弧菌后，myticusin-1 均在2 h 的表達量較對照組有明顯上調(diào)并達到最大值，隨后表達量整體呈下降趨勢。

圖4 在金黃葡萄球菌、溶藻弧菌和白色念珠菌對厚殼貽貝感染后，血細胞中myticusin-1 基因表達量變化Fig.4 Myticusin-1 expression changes in blood cells after infection with S.aureus,V.alginolyticus and C.albicans in M.coruscus

3 討論

貽貝屬濾食性生物，容易造成微生物在體內(nèi)的積累，因此貽貝體內(nèi)眾多的抗菌肽分子對于貽貝的生存至關(guān)重要。myticusin-1 是目前已報道的分子量最大的貽貝抗菌肽。由于myticusin-1 在貽貝體內(nèi)含量極低，因而妨礙了后續(xù)深入研究?？咕牡脑酥亟M表達由于密碼子偏愛性、序列中的二硫鍵以及本身的抑菌活性而成為抗菌肽工程研究中的難點[12]，目前采用原核系統(tǒng)表達真核生物抗菌肽成功的例子并不多。為此，本文采用密碼子優(yōu)化策略，一方面解決原核生物表達真核生物所面臨的的密碼子問題[12-14]，另一方面采用透析復性手段促進重組表達產(chǎn)物的二硫鍵氧化形成[15]。在本研究中，通過密碼子優(yōu)化，重組myticusin-1 在大腸桿菌中的表達量達到10 mg·L-1菌液并且成功復性。但是其氧化復性的效率較低(10%左右)。推測與myticusin-1 二硫鍵數(shù)目較多有關(guān)。這對后續(xù)myticusin-1 的大規(guī)模生產(chǎn)帶來了不小的困難，因此在后續(xù)研究中，針對這種含有多對二硫鍵的目標蛋白的氧化復性依然需要進一步研究，以尋找合適的氧化復性方法。

經(jīng)復性及純化后的重組myticusin-1 表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌的廣譜抑制活性，與天然myticusin-1 相比，其抑菌活性類似，表明重組myticusin-1 經(jīng)氧化復性后，其結(jié)構(gòu)與天然myticusin-1 相似，且N 端的多聚組氨酸標簽未對抑菌活性造成明顯影響。從MIC 值來看，重組myticusin-1 對革蘭氏陽性菌活性較強，而對革蘭氏陰性菌抑制活性較弱，這表明myticusin-1 在抑菌活性方面具有選擇性。目前，多數(shù)已報道的貽貝抗菌肽在抑菌活性方面均表現(xiàn)出選擇性，例如，defensin[6]，mytilin[3]，mytichitin[16]，myticusin-1[9]和myticins[4]均對革蘭氏陽性菌具有較強活性，對革蘭氏陰性菌抑制活性較弱；mytimycin[17]則主要對真菌有抑制活性。貽貝抗菌肽的選擇性機制目前尚不清楚，推測與陽性菌和陰性菌細胞壁的組成差異有關(guān)。進一步的研究表明，厚殼貽貝血細胞myticusin-1 基因?qū)瘘S葡萄球菌的反應(yīng)表現(xiàn)最為敏感，其誘導后表達量上調(diào)倍數(shù)與溶藻弧菌和白色念珠菌誘導組相比為最大。綜合重組myticusin-1 的功能以及myticusin-1 基因在不同微生物誘導后的表達量變化，我們推測，厚殼貽貝myticusin-1 可能在貽貝對抗革蘭氏陽性菌的免疫過程中發(fā)揮著重要作用。

海洋貽貝的生活特性導致海水中的各種微生物與貽貝各組織處于直接接觸狀態(tài)。從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，海水中革蘭氏陰性菌的豐度比革蘭氏陽性菌要大[18]。同時，目前已知海水中貝類的致病菌大多數(shù)是革蘭氏陰性菌，特別是弧菌屬(包括Vibrio alginolyticus、V.splendidus、V.anguillarum、V.tubiashi，V.tapetis，V.aestuarianuns，V.neptunius 等)，假單胞菌屬Pseudomonas 和氣單胞菌屬Aeromonas[19-22]。而革蘭氏陽性菌中，貝類致病菌目前發(fā)現(xiàn)的不多，其主要代表是諾卡氏菌屬(Nocardia，主要感染牡蠣，但致死率不高)[23-24]。厚殼貽貝myticusin-1 對革蘭氏陽性菌的強抑制活性以及myticusin-1 對革蘭氏陽性菌的高敏感性事實上很難解釋貽貝對于其生存環(huán)境微生物群落的適應(yīng)。因此我們推測，貽貝在長期進化過程中已經(jīng)形成了對革蘭氏陰性菌的耐受機制，可能與部分革蘭氏陰性菌形成了共/附生關(guān)系[25]，而貽貝對革蘭氏陽性菌較強的敏感性表明貽貝與革蘭氏陽性菌之間存在較大的不兼容性，因此，myticusin-1 在功能上表現(xiàn)出對陽性菌具有較強的抑制活性，并且其基因表達對陽性菌的脅迫更為敏感。此外，上述研究結(jié)果也表明，貽貝可能通過某種復雜的機制來識別革蘭氏陽性菌和陰性菌，并且分泌不同的抗菌肽來進行免疫防御。對此，還需要更為詳細和更為深入的研究來探討貽貝免疫系統(tǒng)與不同微生物之間的關(guān)聯(lián)以及相互作用機制。