曹婷 姬孟瑤,2 施力光 荀文娟,2 楊德智 侯冠彧

（1.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101；2.海南大學動物科技學院 海南海口 570228；3 內蒙古農業(yè)大學動物科學學院 內蒙古呼和浩特 010018）

儋州雞屬于小型土雞品種，是肉用型地方優(yōu)良品種，又稱儋州小種雞、儋州小種肉雞和儋州北岸小種雞，在儋州市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)皆有養(yǎng)殖。因其肉質鮮嫩，肉香濃郁，屠體皮膚薄，蛋白含量高，肌內脂肪、皮下脂肪含量低等優(yōu)勢，深受廣大消費者的喜愛[1-2]。

雞冠是雞頭部的皮膚衍生物，起源于喙的上方[3-4]。雞冠是優(yōu)質肉雞的一項重要包裝性狀，是消費者選購禽肉產品的重要參考因素[5-7]。雞冠發(fā)育與雞的生長發(fā)育有密切關聯(lián)，遺傳力也較高[8-9]。因此，雞冠的發(fā)育已經成為優(yōu)質肉雞選育的重要目標性狀之一。雞中最為常見的冠型為單冠，就遺傳學研究而言，單冠是野生型性狀，其余則為突變性狀[10-12]。突變的雞冠性狀包括玫瑰冠、豆冠、胡桃冠、雙冠、三叉冠、多冠和無冠，其中不同突變型內又分為若干表型。

雞冠的形態(tài)差異受多因子控制。BMP2(Bone morphogenetic protein 2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白) 基因和CHADL(Chondroadherin-like protein，軟骨蛋白樣蛋白)基因都是被轉錄組測序技術鑒定為參與雞冠發(fā)育的候選基因[13-15]。BMP2和CHADL這2個基因位于雞冠QTL上[16]。其中BMP2屬于轉化生長因子超家族中的一員，它能影響骨的生理機能（繁殖力）和增加骨沉積，刺激成骨細胞增殖和分化，刺激骨的形成，被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子[17]。關于雞BMP2和CHADL基因的研究甚少，尚不確定其在雞冠發(fā)育和分化過程中起到的具體調控作用，可以作為調節(jié)雞冠發(fā)育的候選基因重點研究，為探索雞冠發(fā)育調節(jié)機理提供試驗基礎。

為了進一步探索BMP2和CHADL基因在儋州雞雞冠發(fā)育過程中發(fā)揮的作用，采用免疫印跡（Western Blot）試驗方法，對儋州雞保種選育基地儋州雞主要雞冠形態(tài)（單冠和玫瑰冠）、不同月齡（2月齡至青年期，4月齡至性成熟啟動期，6月齡至性成熟完全期）、不同性別等的雞冠組織進行BMP2、CHADL蛋白水平的表達測定和關聯(lián)性分析；并對性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞、母雞不同冠型進行以上 2個蛋白的表達比較分析。為揭示雞冠發(fā)育調控機制和分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材儋州雞群體均由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所儋州雞選育基地提供，出殼后在相同的營養(yǎng)水平和管理條件下養(yǎng)殖，待到雞冠長到可分辨形態(tài)類型時按照單冠組和玫瑰冠冠組群進行篩選分群，挑選健康單冠、玫瑰冠組群各 150只（公母比例 4∶1），繼續(xù)同條件養(yǎng)殖，準備在2、4、5、6月齡時分別進行雞冠組織樣本采集。

1.1.2 主要試劑儀器一抗：BMP2（博奧森bs-10696R）、CHADL（博奧森 bs-13885R）、β-Actin（博士德 BM0627），二抗：HRP-羊抗兔 IgG+HRP-羊抗小鼠IgG，博士德BA1056，RIPA裂解液，抗體稀釋液，蛋白抑制劑，PBS，電泳液，PVDF膜等。

勻漿機，電泳儀，培養(yǎng)箱，玻璃皿等。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物樣本采集待試驗雞生長到2月齡（青年期）、4月齡（性成熟啟動期）、6月齡（性成熟完全期）時，屠宰并快速采集儋州雞公雞單冠和玫瑰冠雞冠組織（各5只樣本重復）；并在5月齡時（性成熟中期）屠宰并快速采集各5只儋州雞公雞單冠和玫瑰冠、儋州雞母雞單冠和玫瑰冠雞冠中間部分組織。存放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Western blotting檢測蛋白表達采用免疫印跡（Western Blot）試驗方法，對2月齡（青年期）、4月齡（性成熟啟動期）、6月齡（性成熟完全期）儋州雞公雞單冠和玫瑰冠組織進行BMP2、CHADL蛋白表達分析實驗；并對性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞、母雞單冠、玫瑰冠組織進行BMP2、CHADL蛋白表達分析實驗。具體操作如下：

蛋白樣品制備（40 mg左右冷凍雞冠組織樣品勻漿提取蛋白質，含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液作為勻漿介質）→蛋白定量（使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度，并用PBS將每組蛋白稀釋定量，確保每組的蛋白濃度在同一水平）→上樣電泳（將變性后的蛋白以 50 μg總蛋白的上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳）→轉膜（電泳結束后轉移至PVDF膜上）→封閉（在室溫下用封閉緩沖液封閉膜 1 h，然后將膜在TBST中洗滌3次）→一抗孵育（與一抗孵育1.5 h或過夜）→二抗孵育（TBST洗滌 3次并與二抗孵育1小時）→顯影曝光（在膜上均勻滴上ECL發(fā)光液—Biosharp，用發(fā)光圖像分析儀 Champ Chemi系統(tǒng)拍攝照片）。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析灰度值分析：通過Image J軟件進行量化分析（目的蛋白灰度值/內參灰度值），SAS軟件統(tǒng)計分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同冠型、月齡儋州雞公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達分析

蛋白水平表達分析結果顯示：儋州雞公雞的單冠和玫瑰冠組織中BMP2蛋白表達水平在2、4、6月齡的表達趨勢均為由高到低再到高，且在 4到6月齡均差異顯著（p＜0.05，下同）；而CHADL蛋白表達水平呈上升趨勢，但差異不顯著（p＞0.05，下同）；2月齡公雞單冠組中BMP2蛋白表達水平低于玫瑰冠，差異不顯著；4、6月齡公雞單冠組織中 BMP2蛋白表達水平高于玫瑰冠，差異也不顯著；2、6月齡公雞單冠組織中CHADL蛋白表達水平低于玫瑰冠，而 4月齡公雞單冠組織中 CHADL蛋白表達水平高于玫瑰冠，差異均不顯著。表達分析結果見圖1和圖2。

圖1 不同冠型、月齡儋州雞公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達（WB顯色）

圖2 不同冠型、月齡儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL蛋白表達統(tǒng)計分析結果（灰度值）

2.2 性成熟中期不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達分析

蛋白水平表達分析結果顯示：性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞和母雞單冠組織中 BMP2、CHADL蛋白表達水平均高于其在玫瑰冠組，且BMP2蛋白在公雞2冠型組織間的表達差異顯著，2種蛋白表達在母雞 2冠型組織間差異不顯著；性成熟中期玫瑰冠型雞冠組織中公雞的BMP2蛋白表達水平均顯著低于母雞，不同性別和冠型雞冠組織中的CHADL蛋白表達水平差異不顯著表達分析結果見圖3和圖4。

圖3 性成熟中期（5月齡）不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達（WB顯色）

圖4 性成熟中期（5月齡）不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL蛋白表達統(tǒng)計分析結果（灰度值）

3 討論與結論

3.1 討論

雞冠是雞的第二性征中最重要、最明顯的特征，其發(fā)育是成長和性成熟程度的參考指標，也是決定銷售等級和價格的關鍵因素[18]。所以，雞冠的類型和發(fā)育一直是養(yǎng)殖產業(yè)和雞群繁殖育種關注的重點，雞冠的發(fā)育和篩選也已成為優(yōu)質肉雞選育的重要目標性狀之一[8,19]。但仍有很多因素制約著雞冠性狀的選育進展，如世代間隔較長等問題。從分子水平對復雜性狀的遺傳機制進行解析，尋找關鍵的分子標記用于輔助選擇，已經成為提高動物育種進展的重要方法之一。雞冠的形態(tài)差異受多因子控制，但目前在分子水平進行雞冠性狀的研究較少。

BMP2和CHADL基因是參與骨骼和軟骨組織合成的作用基因，也是近年來被轉錄組測序技術鑒定為參與雞冠發(fā)育的候選基因[13-15]。其中有學者通過QTL定位發(fā)現(xiàn)BMP2可共同參與雞冠發(fā)育調控作用[20]；也有研究證實，BMP2基因通過鈣質分配參與雞冠發(fā)育過程[21]；近期有研究發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在雞冠發(fā)育中起到負調控作用[14]；同時也有相關研究人員研究得出，CHADL基因可能在雞冠發(fā)育過程中起到正調控作用，可以促進雞冠發(fā)育[15]；近期有研究表明，CHADL基因也可能通過調控雞冠真皮層膠原纖維的合成作用來參與雞冠發(fā)育[14]。

由于BMP2和CHADL基因被挖掘為調控雞冠發(fā)育的候選基因較晚，且相關機制研究甚少，尚不確定其在雞冠發(fā)育和分化過程中起到的具體作用。近期，王琨等[13]對不同周齡公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因的表達進行分析，結果表明：BMP2基因的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在13周齡時表達量最高(p＜0.05)；而CHADL基因的表達量隨著雞冠發(fā)育逐漸升高(p＜0.05)。并得出BMP2和CHADL分別在雞冠發(fā)育過程中發(fā)揮了抑制/促進雞冠發(fā)育的作用的結論[14]。本文通過對不同月齡的儋州雞公雞不同冠型中這2種基因蛋白水平的表達進行研究發(fā)現(xiàn)，儋州雞公雞的單冠和玫瑰冠組織中BMP2的蛋白表達在2、4、6月齡的表達趨勢均為由高到低再到高，而 4月齡正是肉雞的性成熟啟動期，該階段的雄性第二性征主要性狀——雞冠的發(fā)育可能是一個高峰階段，這個高峰階段的BMP2蛋白表達卻最低；且性成熟中期的雞冠大小排序為公雞玫瑰冠＞公雞單冠＞母雞單冠，這也與 BMP2的表達量呈負相關，所以BMP2的蛋白水平的表達也可能對雞冠的發(fā)育、大小和冠型起到一定的抑制作用；從本研究結果還可以看出，BMP2的蛋白水平表達在性成熟中期公雞的單冠和玫瑰冠差異較顯著，說明BMP2蛋白對儋州雞公雞的冠型和性成熟中期的調控作用較大；而CHADL蛋白的表達量雖然在儋州雞公雞不同月齡和不同冠型的雞冠組織中表達差異不顯著，但呈一定的上升趨勢，這與前期王琨等[14]對該基因的表達趨勢一致，但是由于CHADL蛋白水平的表達差異并不顯著，所以本試驗不能確定CHADL的蛋白表達是否對雞冠的表型和生長發(fā)育存在調控關聯(lián)作用，還需要進一步研究探索。

3.2 結論

儋州雞雞冠形態(tài)的差異和發(fā)育階段的不同與BMP2、CHADL基因蛋白水平的表達有一定的關聯(lián)性，其中BMP2較為明顯。BMP2基因的表達量與儋州雞雞冠冠型大小和生長月齡呈負相關，可能在調控雞冠發(fā)育上存在抑制作用，其調控作用在性成熟期間較為顯著，并且主要體現(xiàn)在公雞群體中。