代秦丹 黎光楊 汪 成 馬 健 胡 瑞 李 翔 姚小鶴 鄒華圍 王之盛 彭全輝 薛 白 王立志

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所/四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

我國(guó)擁有非常豐富的低成本粗飼料和非常規(guī)飼料資源，這類飼料具有質(zhì)地粗硬，粗纖維含量高及蛋白質(zhì)含量低等缺點(diǎn)，在畜牧生產(chǎn)利用中受到限制。一般需要通過(guò)合理加工來(lái)改善其利用率，例如物理、化學(xué)和生物學(xué)方法[1]，其中生物學(xué)方法對(duì)環(huán)境友好且具有良好前景[2]。農(nóng)業(yè)部“十三五”規(guī)劃也明確提出生物飼料產(chǎn)業(yè)發(fā)展是供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重要突破口。因?yàn)樯镲暳喜粌H在改善飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上發(fā)揮作用，也是無(wú)抗飼料的重要組成部分。粗飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后能提高蛋白質(zhì)含量[3]，改善氨基酸組成，同時(shí)獲得有益的微生物代謝產(chǎn)物[4]。生物發(fā)酵飼料應(yīng)用廣泛，按總量普及率的20%計(jì)算，2018年發(fā)酵飼料總量約195萬(wàn)t[5]。

白酒糟在我國(guó)產(chǎn)量巨大，據(jù)估計(jì)2019年我國(guó)白酒糟產(chǎn)量可達(dá)2 115萬(wàn)t[6]。由于白酒在釀造的過(guò)程中會(huì)添加45%左右的稻殼，導(dǎo)致白酒糟木質(zhì)纖維素含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低，有機(jī)物消化率低[7]，在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物中的實(shí)際利用率有限。利用微生物發(fā)酵后，酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均有明顯改善[8-9]。利用微生物發(fā)酵方式改善白酒糟的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要集中于降低纖維含量，提高蛋白質(zhì)含量。能降解纖維的微生物主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌，其中細(xì)菌比真菌有更強(qiáng)的環(huán)境耐受性以及功能多樣性，比多數(shù)放線菌有更強(qiáng)的纖維酶活[10]，已在飼料、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮作用。目前能在飼料發(fā)酵上應(yīng)用的飼用細(xì)菌較少，例如釀酒酵母[11]和枯草芽孢桿菌[12]等，但以上菌種產(chǎn)酶種類有限。因此，為滿足現(xiàn)代工業(yè)需求，獲得新的生物催化劑來(lái)源，尋找新的環(huán)境友好型和高效率的菌種是飼料發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。

芽孢桿菌類細(xì)菌是一類重要的益生菌，飼用芽孢桿菌能生產(chǎn)飼用酶，飼用活性代謝產(chǎn)物以及作為腸道益生菌等，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高動(dòng)物健康，在飼料資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用上有很大的發(fā)展空間[13]。芽孢桿菌在自然界廣泛存在，柯恩氏菌屬是其中一種，該屬的成員來(lái)自于多種環(huán)境中，如土壤、淡水和植物根系等。研究發(fā)現(xiàn)某些柯恩氏菌屬于木聚糖[14]、纖維素和半纖維素溶解菌[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期從腐殖土中應(yīng)用平板法分離出一株具有明顯纖維降解效果的細(xì)菌，但對(duì)其種屬、生理生化特性以及對(duì)飼料纖維的降解效果尚不明確。因此，本研究旨在對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一株纖維降解菌進(jìn)行鑒定，并以白酒糟為發(fā)酵底物，探究其對(duì)飼料纖維的降解效率，從而為該菌在低品質(zhì)高纖維飼料開(kāi)發(fā)與利用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1菌株

本研究所用菌株T5為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室前期篩選保藏的菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母浸提物，5.0 g氯化鈉，溶于1 L蒸餾水，121 ℃滅菌30 min，作為種子液培養(yǎng)基。

鑒別培養(yǎng)基：7.5 g羧甲基纖維素鈉，1.0 g KH2PO4，1.0 g蛋白胨，0.5 g酵母膏，0.5 g MgSO4·7H2O，1.5 g NaCl，20.0 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g發(fā)酵底物(m(麩皮)∶m(濃香型干酒糟)=1∶9，干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ))，1.5%尿素(以占發(fā)酵底物干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算)，置于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。酒糟購(gòu)于宜賓五糧液酒廠，經(jīng)65 ℃烘干制成干酒糟，麩皮采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地。

1.2 菌株的活化與鑒定

1.2.1菌株的活化及種子液的確定

取-80 ℃保藏的菌液，于4 ℃解凍后，接種到鑒別培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后，挑取一接種環(huán)的菌株接種到含50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于39 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，作為種子液。此菌液濃度下進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，其濃度約為3.48×107CFU/mL。

1.2.2菌株的鑒定

在電鏡下進(jìn)行菌株的形態(tài)觀察，部分生理生化指標(biāo)檢測(cè)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]。

利用引物16S rRNA擴(kuò)增引物(通用引物)正向引物Forward為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物Reverse為：5′-TACGGCTACCTTGTT-ACGACTT-3′進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。提取菌株T5的基因組DNA，以之為模板，用引物擴(kuò)增其16S rDNA片段，送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)，借助MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 發(fā)酵白酒糟試驗(yàn)

1.3.1單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵因素進(jìn)行初步探索和優(yōu)化，即發(fā)酵溫度(30、33、36、39和42 ℃)；發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5、6和7 d)；種子液添加量(5%、10%、15%、20%、25%和30%)和料水比(1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00和1∶2.25)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。其中添加量為占發(fā)酵底物DM質(zhì)量分?jǐn)?shù)，料水比為料(DM基礎(chǔ))與水質(zhì)量比。發(fā)酵結(jié)束后，65 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，測(cè)定粗蛋白質(zhì)(CP)和中性洗滌纖維(NDF)含量。

1.3.2正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(L9(34))繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、添加量(C)和料水比(D)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，65 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，測(cè)定NDF和CP含量。

1.3.3最優(yōu)條件發(fā)酵白酒糟

最優(yōu)條件下發(fā)酵白酒糟，比較對(duì)照組與發(fā)酵組營(yíng)養(yǎng)成分和酒糟結(jié)構(gòu)的變化，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，取約2 g發(fā)酵樣品，臨界點(diǎn)干燥后，用電鏡專用膠帶將樣品固定在臺(tái)支架上，經(jīng)干燥噴金處理，利用掃描電鏡(HITACHI Regulus 8100)進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)觀察。剩余樣品于65 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析。

1.4 體外試驗(yàn)

1.4.1瘤胃液的采集

瘤胃液于晨飼前2 h，用胃管式瘤胃液采樣裝置抽取3頭1歲左右體況良好的筠連黃牛瘤胃液，將3頭牛的瘤胃液混勻，經(jīng)4層無(wú)菌紗布過(guò)濾到充滿CO2的保溫瓶中，并迅速運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。筠連黃牛飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地。

1.4.2體外發(fā)酵試驗(yàn)

參照Menke等[17]方法配制人工唾液，按照祝伊梟等[18]描述的方法進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)，記錄3、6、9、12、24、48和72 h的發(fā)酵管刻度。發(fā)酵結(jié)束后，用鋁箔集氣袋收集氣體，待測(cè)甲烷(CH4)體積分?jǐn)?shù)，然后將發(fā)酵管置于冰水中終止發(fā)酵，將發(fā)酵管中的發(fā)酵液用預(yù)先恒重的尼龍袋過(guò)濾，留下濾渣，用于干物質(zhì)降解率(IVDMD)的測(cè)定。濾液分裝于10 mL無(wú)菌離心管中，測(cè)發(fā)酵液pH，其余-20 ℃保存，用于氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)質(zhì)量濃度的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算

干物質(zhì)(DM)、粗脂肪(EE)和粗灰分(Ash)分別按照GB/T 6435—1986、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007測(cè)定，粗蛋白質(zhì)(CP)、真蛋白(TP)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測(cè)定參照張麗英的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[19]。

按以下公式[20]計(jì)算累積產(chǎn)氣量(GP)：

GPt=200×(Vt-V0)/W

(1)

式中：GPt為t時(shí)間點(diǎn)的累積產(chǎn)氣量，mL/mg；Vt為樣品發(fā)酵t時(shí)間后發(fā)酵管刻度讀數(shù)；V0為樣品在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)空白培養(yǎng)管刻度讀數(shù)；W為樣品干物質(zhì)質(zhì)量，mg。

利用氣相色譜儀(CP-3800)法[21]測(cè)各揮發(fā)性脂肪酸(VFA)質(zhì)量濃度，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)質(zhì)量濃度為各VFA質(zhì)量濃度之和。發(fā)酵液pH使用雷磁25型pH酸度計(jì)測(cè)定。苯酚—次氯酸鹽比色法[22]測(cè)定NH3-N質(zhì)量濃度。參照莊二林[23]的BCA蛋白定量測(cè)試盒法測(cè)定MCP質(zhì)量濃度，試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。參照周芯宇等[24]描述的氣相色譜儀(福立GC9790Ⅱ)法測(cè)定CH4百分含量，并計(jì)算CH4產(chǎn)量，即CH4產(chǎn)量=72 h GP×CH4體積分?jǐn)?shù)。IVDMD%=100×((尼龍袋重+樣重)-過(guò)濾后的尼龍袋和濾渣重)/樣重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，用GraphPad Prism 8.0繪制單因素試驗(yàn)結(jié)果和產(chǎn)氣量變化圖，并用SPSS 20.0進(jìn)行二次回歸統(tǒng)計(jì)分析；對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析；發(fā)酵前后酒糟營(yíng)養(yǎng)成分和瘤胃發(fā)酵特性結(jié)果進(jìn)行One-way ANOVA分析，結(jié)果用平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)及部分生理生化鑒定

從圖1掃描電鏡下可以觀察到菌株呈桿狀，由表1可知，菌株革蘭氏染色和甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，不能分解淀粉，但可降解纖維二糖、葡萄糖和蔗糖，屬兼性厭氧菌。此結(jié)果表明菌株T5為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，能利用葡萄糖生成有機(jī)酸。

圖1 掃描電鏡下菌株T5的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphological structure of the strain T5 by scanning electron microscope

表1 菌株T5的部分生理生化特征Table 1 Some physiological and biochemical characteristics of strain T5

2.1.2菌株T5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

測(cè)序后，應(yīng)用NCBI-BLAST在線分析工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性比對(duì)，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示，菌株T5與Cohnellaxylanilytica聚為一支，他們的親緣關(guān)系最近，且BLAST分析中菌株T5與Cohnellaxylanilytica的16S rRNA序列的相似性最高，達(dá)99.57%。以上結(jié)果表明該菌株為Cohnellaxylanilytica，可命名為Cohnellaxylanilyticastrain T5。

線段0.005表示序列差異的分支長(zhǎng)度，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為GenBank登錄號(hào)。Line segment 0.005 represents the branch length of sequence difference, and the number in parentheses is the GenBank login number.圖2 菌株T5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain T5

2.2 單因素發(fā)酵條件的優(yōu)化

如圖3所示，隨著溫度、時(shí)間、添加量和料水比因素的梯度變化，NDF和CP含量也隨之變化。如表2所示，當(dāng)發(fā)酵溫度分別為36.26和35.99 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為4.92和5.28 d，添加量分別為19.08%和17.33%，含水量分別為59.25%和56.86%(料水比在1∶1.25～1∶1.50)時(shí)，NDF和CP增長(zhǎng)率分別達(dá)到最優(yōu)值。回歸分析最適值結(jié)合圖3中各因素的NDF和CP增長(zhǎng)率的變化趨勢(shì)可以確定菌株T5進(jìn)行正交試驗(yàn)的各因素水平：發(fā)酵溫度分別為30、33和36 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為4、5和6 d，添加量分別為15%、20%和25%，料水比分別為1∶1.25、1∶1.50和1∶1.75。

圖中左縱坐標(biāo)表示NDF和CP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍，右縱坐標(biāo)代表NDF和CP增長(zhǎng)率的變化范圍。The left longitudinal coordinate in the figure represents the change range of NDF and CP mass fraction, and the right longitudinal coordinate represents the change range of NDF and CP growth rate.圖3 菌株T5發(fā)酵酒糟單因素試驗(yàn)分析Fig.3 Single factor test analysis of strain T5 fermented distillers’ grains

表2 菌株T5發(fā)酵酒糟單因素試驗(yàn)的回歸分析Table 2 Regression analysis of single factor test for strain T5 fermented distillers’ grains

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

2.3 正交試驗(yàn)

表4 菌株T5正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析表Table 4 Table of extreme differential analysis of the results of the orthogonal tests for strain T5

表5 菌株T5正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表Table 5 Analysis of variance of strain T5 orthogonal test results

2.4 發(fā)酵酒糟前后營(yíng)養(yǎng)成分變化

由表6可知，對(duì)照組和T5發(fā)酵組的CP、TP、CF、NDF、ADF和Ash質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著(P<0.05)，而EE質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著(P>0.05)。T5發(fā)酵組CP和TP質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)于對(duì)照組分別增加了19.68%和30.38%；Ash質(zhì)量分?jǐn)?shù)由8.90%增加到9.25%；而EE、CF、NDF和ADF相對(duì)于對(duì)照組都有不同程度的降低。其中NDF、ADF和CF質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了31.68%、27.69%和7.95%，EE質(zhì)量分?jǐn)?shù)由13.70%降低到12.66%。此結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，發(fā)酵酒糟組的纖維含量有較大幅度降低，并且蛋白含量有所增加。

表6 發(fā)酵酒糟前后營(yíng)養(yǎng)成分變化(DM基礎(chǔ))Table 6 The changes of nutrient composition before and after fermentation of distillers’ grains (DM basis)

2.5 發(fā)酵前后掃描電鏡對(duì)比

由圖4掃描電鏡結(jié)果可知，對(duì)照組的掃描電鏡結(jié)果顯示酒糟的結(jié)構(gòu)比較完整，而T5發(fā)酵組的酒糟結(jié)構(gòu)松散不完整，表面出現(xiàn)大量蜂窩狀孔洞(剪頭指向)，并有明顯的菌株附著(圓內(nèi))。此結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，菌株T5發(fā)酵酒糟可破壞酒糟結(jié)構(gòu)。

(a)和(b)為對(duì)照組，(c)和(d)為T(mén)5發(fā)酵組。(a) and (b) represent control group, (c) and (d) represent T5 fermentation group.圖4 發(fā)酵前后酒糟的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of before and after fermentation

2.6 酒糟發(fā)酵前后的瘤胃發(fā)酵特性

由圖5和表7可知，對(duì)照組的GP在12～72 h時(shí)間段均高于T5發(fā)酵組，且72 h GP有顯著高于T5發(fā)酵組的趨勢(shì)(P=0.06)。此外，T5發(fā)酵組的NH3-N、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸質(zhì)量濃度以及IVDMD均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但MCP質(zhì)量濃度和乙酸/丙酸差異不顯著(P>0.05)。而對(duì)照組的CH4百分含量和產(chǎn)量顯著高于T5發(fā)酵組(P<0.05)。這表明，與對(duì)照組相比，發(fā)酵酒糟組的產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量降低，而VFA、TVFA和NH3-N質(zhì)量濃度均有不同程度的升高。

圖5 對(duì)照組和T5發(fā)酵組的累積產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)變化比較Fig.5 Comparison of dynamic changes of cumulative gas production in control group and T5 fermentation group

表7 菌株T5發(fā)酵酒糟前后體外發(fā)酵參數(shù)的變化Table 7 Changes of in vitro fermentation parameters of before and after fermentation of distiller’s grains

3 討 論

3.1 菌株T5的鑒定及發(fā)酵白酒糟的工藝條件優(yōu)化

根據(jù)菌株16S rRNA測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)菌株T5隸屬于柯恩氏菌屬，與Cohnellaxylanilytica的相似性最高。Khianngam等[25]研究發(fā)現(xiàn)一株Cohnellaxylanilytica具有降解纖維作用，這與本研究結(jié)果一致。該菌屬兼性厭氧菌，在發(fā)酵工程中能較好的適應(yīng)有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵，一定程度上可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)工程菌株提供菌源。

本研究所用種子液是根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線確定，將菌接種到LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期剛結(jié)束時(shí)，此時(shí)菌株生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酶活性達(dá)最高[26-27]。固態(tài)發(fā)酵通常以營(yíng)養(yǎng)均衡的發(fā)酵底物為基礎(chǔ)，加入益生菌和水，在適宜溫度的好氧或厭氧環(huán)境下發(fā)酵[28]。本研究考慮到白酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低，所以發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麩皮，為微生物生長(zhǎng)產(chǎn)酶提供碳源。由于酒糟酸度高，pH一般在3.51～4.56，培養(yǎng)基添加尿素，可以達(dá)到調(diào)節(jié)pH，增加氮源的目的。此外對(duì)于粗飼料而言，還可以起到氨化的作用。例如張玉誠(chéng)[29]在發(fā)酵酒糟時(shí)，添加了一定比例的麩皮、玉米粉和菜籽粕以及1.5%尿素；張博潤(rùn)等[30]添加了麥芽根粉和2%尿素。

為達(dá)到更好的發(fā)酵效率，有必要優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，促進(jìn)飼料中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化[31]。本研究對(duì)發(fā)酵效果影響最大的因素是溫度和料水比，其次是種子液和接種量，影響最小的是發(fā)酵時(shí)間。溫度除了影響菌株的生長(zhǎng)繁殖外，還會(huì)影響其酶活。Pisa等[32]研究發(fā)現(xiàn)一株Cohnellasp. AR92的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，Huang等[33]發(fā)現(xiàn)一株Cohnellananjingensissp. nov.的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。本研究菌株T5的最適發(fā)酵溫度為33 ℃，在前人研究范圍內(nèi)。發(fā)酵環(huán)境中的水分直接影響菌株的生存環(huán)境和活性，從而影響菌株產(chǎn)酶效果[34]。Li等[11]研究表明粗糙脈孢菌單菌發(fā)酵豆粕和粗糙脈孢菌和釀酒酵母混菌發(fā)酵的最大影響因素之一就是料水比。此外,于海漫[35]用單菌發(fā)酵白酒糟，物料含水量在60%最適，這與本研究結(jié)果一致。種子液添加量也是影響發(fā)酵的重要因素，添加量過(guò)低，菌株繁殖緩慢，且易受雜菌污染，添加量過(guò)多，則會(huì)縮短菌株的生長(zhǎng)周期，且大量菌株代謝產(chǎn)物聚集，會(huì)影響菌株活性物質(zhì)的形成[36]。

3.2 菌株T5對(duì)白酒糟纖維的降解效果

酒糟是一類特殊的非常規(guī)飼料資源，其非淀粉多糖(NSP)含量高，并且還含有殘留的酵母細(xì)胞和酵母細(xì)胞成分、活性生長(zhǎng)因子和未知生長(zhǎng)因子等[37]。NSP是飼料纖維的主要成分，能將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包裹起來(lái)，妨礙動(dòng)物消化吸收。如將這些NSP去除，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就能從細(xì)胞壁里釋放出來(lái)，從而提高碳水化合物利用率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后酒糟的纖維含量顯著降低，并且掃描電鏡結(jié)果展示酒糟結(jié)構(gòu)被破壞，說(shuō)明菌株T5在纖維降解上發(fā)揮作用，且從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度上說(shuō)，這有利于家畜消化吸收。發(fā)酵底物在尿素氨化和滅菌作用下，纖維結(jié)構(gòu)之間的氫鍵被打斷，暴露出結(jié)晶纖維素內(nèi)核，把纖維素從木質(zhì)素的包裹中釋放出來(lái)，增加發(fā)酵培養(yǎng)基之間的孔隙度以及纖維素和微生物的接觸面積，利于纖維降解[38]。發(fā)酵過(guò)程中纖維被降解，轉(zhuǎn)化為單糖和二糖，并伴隨著水和二氧化碳的產(chǎn)生，有機(jī)物的比例相對(duì)降低，而微生物難利用的無(wú)機(jī)物相對(duì)增加，表現(xiàn)為發(fā)酵酒糟Ash含量增加。值得關(guān)注的是，本研究發(fā)酵酒糟CP和TP含量也明顯升高，可能原因是纖維含量降低，相對(duì)升高了蛋白含量，同時(shí)菌株T5可能利用尿素氮源用于自身生長(zhǎng)，并生成微生物蛋白，此外菌株T5菌體本身也含有蛋白質(zhì)組分。與本課題組前期混菌發(fā)酵白酒糟NDF含量降低了18.12個(gè)百分點(diǎn)[29]相比，本研究NDF降解效果與之相似，可能是因?yàn)楸狙芯堪l(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌以及在最適的物理?xiàng)l件下進(jìn)行的發(fā)酵。劉鵬[39]利用酶菌混合固態(tài)發(fā)酵白酒糟，CF降幅為42%。宋善丹等[40]混菌固態(tài)發(fā)酵白酒糟，NDF降幅25.53%，CP增率22.32%。與以上研究相比，本研究菌株T5單菌發(fā)酵白酒糟，可達(dá)到降解纖維含量，改善蛋白含量的目的。

3.3 體外產(chǎn)氣法評(píng)定發(fā)酵白酒糟的瘤胃發(fā)酵特性

不同類型飼料作為發(fā)酵底物，體外發(fā)酵產(chǎn)氣特性會(huì)有一定差異。GP某種程度上反映瘤胃微生物的降解活性和飼料降解率[41]。T5發(fā)酵組表現(xiàn)出較低GP，可能是因?yàn)門(mén)5發(fā)酵組中酒糟CP含量相對(duì)較高的原因，因?yàn)榱鑫府a(chǎn)氣主要基于碳水化合物的降解，而飼料蛋白對(duì)GP貢獻(xiàn)不大。由于對(duì)照組還保留較多的難降解碳水化合物以及較低的CP含量，所以GP較高。飼糧營(yíng)養(yǎng)組成是影響CH4產(chǎn)生的重要因素，一般低質(zhì)的粗飼料CH4產(chǎn)量大[42]。瘤胃微生物利用碳水化合物生成CO2和H2，然后經(jīng)甲烷菌還原生成CH4[43]。對(duì)照組的CH4產(chǎn)量更高，一是因?yàn)槠淇赡芨兄诩淄榫纳L(zhǎng)[44]，二是因?yàn)閷?duì)照組纖維含量高，有助于瘤胃纖維降解菌的附著，纖維降解菌活性增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的H2和CO2供甲烷菌利用。這也表明經(jīng)菌株T5發(fā)酵的酒糟飼喂反芻動(dòng)物，可能達(dá)到一定的減排作用。瘤胃NH3-N濃度能反映瘤胃氮代謝，也能間接反映瘤胃微生物分解飼料CP產(chǎn)生NH3-N和利用NH3-N合成MCP的平衡情況[45]。因?yàn)榫圃惆l(fā)酵過(guò)程中添加了尿素，再加上體外發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的NH3-N不能經(jīng)瘤胃上皮吸收，所以試驗(yàn)結(jié)果中的NH3-N質(zhì)量濃度高于正常范圍值[46]。本研究MCP質(zhì)量濃度差異不顯著，而T5發(fā)酵組的NH3-N質(zhì)量濃度高于對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)菌株T5發(fā)酵后的酒糟蛋白質(zhì)可能更容易被瘤胃微生物利用分解成NH3-N。此外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵組的IVDMD顯著高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)榫圃憬?jīng)發(fā)酵后，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物和可消化有機(jī)物含量增加，也可能與對(duì)照組相比，發(fā)酵組的碳氮比更適于瘤胃微生物的利用。

VFA是維持反芻動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的主要能量來(lái)源，能提供反芻動(dòng)物能量需要的70%～80%，其中乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生TVFA的95%左右[42]。本課題組前期探索了不同酒糟的瘤胃發(fā)酵特性，發(fā)現(xiàn)不同酒糟NDF含量與乙酸含量呈負(fù)相關(guān)，與丙酸含量呈正相關(guān)[47]。Gastelen等[48]報(bào)道，高淀粉含量?jī)A向于丙酸的生成，低淀粉含量?jī)A向于乙酸的生成。研究表明目前還沒(méi)有確切的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ突蚧瘜W(xué)計(jì)量模型對(duì)瘤胃VFA產(chǎn)量和比例進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)[49]。一般而言，經(jīng)白酒釀造后，白酒糟的淀粉含量低，但本研究發(fā)酵組的各VFA和TVFA質(zhì)量濃度均高于對(duì)照組。分析其原因可能是對(duì)照組由于含有較高比例的致密性結(jié)構(gòu)碳水化合物，導(dǎo)致瘤胃纖維降解菌不能充分利用，而發(fā)酵酒糟經(jīng)微生物作用后，木質(zhì)纖維降解成可利用的碳水化合物，可消化養(yǎng)分增加，因此表現(xiàn)為各VFA含量均有所升高。此外菌株的甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，證明菌株能利用葡萄糖產(chǎn)生甲酸、乙酸和乳酸等有機(jī)酸。在烘干過(guò)程中會(huì)有部分揮發(fā)，但培養(yǎng)基中仍會(huì)有部分有機(jī)酸殘留，這也是VFA質(zhì)量濃度均升高的原因之一。

4 結(jié) 論

經(jīng)鑒定菌株T5為Cohnellaxylanilytica，其在最佳工藝條件下發(fā)酵酒糟，可以破壞酒糟的結(jié)構(gòu)，降解纖維含量，提高蛋白含量。初步評(píng)定該發(fā)酵酒糟在反芻動(dòng)物上應(yīng)用具有減少甲烷能損失，改善能量供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率的作用。因此菌株T5具有改善白酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的效果，一定程度上可作為飼料資源開(kāi)發(fā)的候選菌株。