趙 麗，馮娟娟，張臘梅，朱晴晴

(山東潔晶集團(tuán)股份有限公司質(zhì)量管理部，山東 日照 276826)

巖藻黃素(Fucoxanthin)，是存在于褐藻、硅藻、無(wú)脊椎海洋動(dòng)物中的具有含氧多烯烴及共軛結(jié)構(gòu)的脂溶性偏極性類胡蘿卜素[1]，其中以全反式結(jié)構(gòu)為主(見(jiàn)圖1)。

圖1 全反式巖藻黃素結(jié)構(gòu)式

羊棲菜中，巖藻黃素的含量相對(duì)較高，有企業(yè)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，但是因巖藻黃素價(jià)格較高，市場(chǎng)上冒充品也隨即誕生，主要以玉米黃素冒充品較多。目前，巖藻黃素已被國(guó)內(nèi)外科研結(jié)果證實(shí)，具有多種生理活性[2-6]。2008年前后，國(guó)內(nèi)就有企業(yè)開(kāi)始以褐藻為原料，進(jìn)行工業(yè)化提取巖藻黃素，推出純度0.5%～5%范圍的巖藻黃素產(chǎn)品，主要用于出口。日本、美國(guó)等已經(jīng)對(duì)該產(chǎn)品的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，并認(rèn)可[7-8]。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)巖藻黃素作為新食品補(bǔ)充劑，歐洲、日本、韓國(guó)均準(zhǔn)許并有市場(chǎng)已流通的產(chǎn)品，應(yīng)用領(lǐng)域以食品、保健品為主導(dǎo)，輔以化妝品領(lǐng)域，也有部分原料來(lái)自中國(guó)。國(guó)內(nèi)巖藻黃素產(chǎn)品受檢測(cè)方法、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等方面的限制，用于食品的生產(chǎn)許可方面還是空白，這在很大程度上限制和阻礙了巖藻黃素在國(guó)內(nèi)食品等領(lǐng)域的推廣。

利用有機(jī)溶劑提取，是目前生產(chǎn)巖藻黃素的主要方法。雖然有研究采用高效液相色譜法(HPLC法)對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)[9-11]，但目前市場(chǎng)上的產(chǎn)品，主要采用紫外分光光度計(jì)法(UV法)檢測(cè)含量，存在不能消除產(chǎn)品中以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素混淆巖藻黃素的可能，檢測(cè)區(qū)分度較小。為了區(qū)分以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素混淆巖藻黃素的情況，同時(shí)也進(jìn)一步為規(guī)范市場(chǎng)提供參考，本研究采用薄層層析與HPLC聯(lián)合的方法，對(duì)羊棲菜醇提物中巖藻黃素進(jìn)行雙重定性和定量分析。先以巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行薄層層析鑒別[12]，若確定產(chǎn)品中含巖藻黃素且不含以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素，再進(jìn)一步進(jìn)行HPLC法二次定性，同時(shí)進(jìn)行含量檢測(cè)。本研究不僅可以促進(jìn)企業(yè)合理調(diào)整工藝，完善檢測(cè)手段，為產(chǎn)品性能提供指導(dǎo)依據(jù)，而且還可以更好地促進(jìn)行業(yè)技術(shù)升級(jí)、產(chǎn)業(yè)進(jìn)步，有利于生產(chǎn)和貿(mào)易的發(fā)展。同時(shí)，在提高巖藻黃素產(chǎn)品質(zhì)量的美譽(yù)度以及市場(chǎng)的認(rèn)可度，促進(jìn)商品流通和維護(hù)公平競(jìng)爭(zhēng)等方面發(fā)揮積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊棲菜醇提物由山東潔晶集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度w≥95.0%)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度w≥85%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；分析純乙醇、優(yōu)級(jí)純正己烷、色譜純乙腈、色譜純甲醇，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；分析純丙酮，購(gòu)于煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器設(shè)備

SB-800DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；P-I型薄層色譜展開(kāi)缸(上海信誼儀器廠有限公司)；硅膠G薄層板(青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司)；高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)(美國(guó)Waters公司)；C18色譜柱(φ4.6 mm×150 mm，5 μm)(美國(guó)Waters公司)；Exceed-Cc-100艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(成都艾柯水處理設(shè)備有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巖藻黃素的薄層色譜鑒定

1)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的配制

取巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品各 1 mg，分別加入試管中并加入適量乙醇；超聲使之完全溶解，分別轉(zhuǎn)移至 5 mL 容量瓶中；加乙醇配制成質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 的溶液，避光保存。取試樣 0.1 g，于試管中，加入適量乙醇，超聲使之完全溶解，轉(zhuǎn)移至 5 mL 容量瓶中定容，避光保存。

2)薄層色譜操作

分別吸取對(duì)照品溶液、試樣溶液各 5 μL，點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上。將點(diǎn)好的薄層板放入展開(kāi)缸中，進(jìn)入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn) 5 mm 為宜，密閉。在正己烷-丙酮(體積比6.5∶3.5)展開(kāi)劑中，展開(kāi)距離約 8 cm，取出薄層板，標(biāo)記展開(kāi)劑前沿位置，晾干后檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求在 1 h 內(nèi)完成。

3)薄層色譜結(jié)果判定

置可見(jiàn)光下檢視，與巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，試樣色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，呈黃色或黃棕色。與玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。按照中國(guó)藥典中的薄層色譜方法[13]計(jì)算比移值Rf，且試樣比移值和巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品比移值相差范圍應(yīng)在3%以內(nèi)。

1.3.2 巖藻黃素含量的高效液相色譜法檢測(cè)

1)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的配制

將巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用乙腈逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾至液相瓶中待測(cè)。

根據(jù)樣品目標(biāo)含量的不同，準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣 0.02～0.06 g(精確至 0.0001 g)，加入少量乙醇，放入超聲波清洗儀中超聲 5 min 使其溶解充分，樣品用乙醇定容至 100 mL 棕色容量瓶中，超聲脫氣、經(jīng)濾膜過(guò)濾至液相進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

2) 高效液相色譜條件

色譜柱：C18色譜柱，φ4.6 mm×150 mm，5 μm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相：溶劑A：乙腈(80%)；溶劑B：純水(20%)；紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng) 450 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊棲菜醇提物中巖藻黃素的薄層色譜鑒定

經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證：巖藻黃素Rf值范圍在0.40～0.49之間，而玉米黃素Rf值大于0.5。玉米黃素的比移值相對(duì)于巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品偏高，能夠明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)，如圖2。圖2中，自左到右分別為：玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品、巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品、羊棲菜醇提物樣品、羊棲菜醇提物樣品平行。樣品比移值和巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品比移值相差范圍均在2%～3%之間。

1.玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品；2.巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品；3.羊棲菜醇提取物；4.羊棲菜醇提物。圖2 玉米黃素、巖藻黃素標(biāo)品及樣品薄層色譜日光圖

2.2 羊棲菜醇提物中巖藻黃素的HPLC檢測(cè)

2.2.1 方法線性范圍

將巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液使用乙腈逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為 0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，上機(jī)測(cè)定，在此范圍內(nèi)巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與響應(yīng)值呈線性相關(guān)，線性方程為y=195.25x+4.1548，相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性回歸曲線見(jiàn)圖3。由圖3知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。巖藻黃素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖4。

圖3 巖藻黃素濃度與峰面積的線性回歸關(guān)系 圖4 巖藻黃素對(duì)照品色譜圖

2.2.2 檢出限、定量限

檢出限：將巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至3倍信噪比附近，重復(fù)驗(yàn)證6次，得出儀器3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的檢出限質(zhì)量濃度為 0.025 mg/L。定量限：將提取后的樣品待測(cè)液稀釋至低質(zhì)量濃度水平，使該質(zhì)量濃度水平信噪比接近10，重復(fù)驗(yàn)證6次，得出褐藻油樣品定量限為 20 mg/kg，褐藻粉末樣品定量限為 200 mg/kg。

2.2.3 樣品測(cè)定

羊棲菜醇提物6次平行樣品中巖藻黃素含量測(cè)定結(jié)果平均為 531 mg/kg，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%，6次平行樣品中巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖5。在 11.4 min 左右出目標(biāo)峰，表明方法的專屬性良好。

表1 樣品巖藻黃素測(cè)定結(jié)果

圖5 樣品色譜圖

2.2.4 加標(biāo)回收率

樣品定量限以及樣品含量選擇三個(gè)加標(biāo)水平分別為100、200 和 400 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6次平行測(cè)試，加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表2。加標(biāo)水平在 100～400 mg/kg 范圍內(nèi)時(shí)，回收率在97.5%～99.3%。

表2 樣品回收率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用薄層色譜和高效液相色譜聯(lián)合的方法，對(duì)羊棲菜醇提物中巖藻黃素進(jìn)行了雙重定性和定量分析。首先定性檢測(cè)，確保產(chǎn)品中不含以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素；定性確認(rèn)后，再經(jīng)過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。定量操作準(zhǔn)確、回收率高、重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室提取的以及企業(yè)生產(chǎn)的羊棲菜醇提物的質(zhì)量以及規(guī)范市場(chǎng)提供依據(jù)。本文也可作為其他原料所提取的巖藻黃素及其加工產(chǎn)品中巖藻黃素含量的定性、定量檢測(cè)提供參考。