肖海璐 盧 彬 劉利華 譚興友 牛李莉 魯 楠 姚樹(shù)蘭 劉 香

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，山東濟(jì)寧，272000；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧，272000

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是性傳播感染中最常見(jiàn)的病原體之一，按其引起的良性或惡性病變分為低危型和高危型。低危型HPV感染?？梢鸶亻T(mén)生殖器疣等良性增生性疾病，而持續(xù)的高危型HPV感染可導(dǎo)致上皮內(nèi)瘤變和癌變[1]。臨床上，男性感染高危型HPV通常無(wú)明顯癥狀，且男性感染后不僅有癌變風(fēng)險(xiǎn)，還可能會(huì)導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生[2]。此外，不同地區(qū)男性感染HPV亞型的分布也不同[3-6]。目前尚無(wú)魯西南地區(qū)男性HPV感染的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，本研究運(yùn)用PCR+膜雜交法技術(shù)，對(duì)魯西南地區(qū)就診的552例男性HPV感染者進(jìn)行分型檢測(cè)并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析，為本地區(qū)男性HPV感染流行病學(xué)調(diào)查、臨床防治和HPV疫苗接種提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究為回顧性分析。納入2017年1月至2021年7月于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科門(mén)診HPV 基因分型檢測(cè)陽(yáng)性的552例男性患者標(biāo)本。標(biāo)本取自男性包皮、冠狀溝、尿道口及肛周等處。采集的標(biāo)本立即放入專用采集管中，冷藏保存并送往本院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行HPV檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究通過(guò)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 研究方法 收集并分析患者的基本信息和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。人乳頭狀瘤病毒(HPV)分型檢測(cè)試劑盒(PCR+膜雜交法)，由廣東潮州凱普生化公司生產(chǎn)，PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI 2720。

1.2.1 HPV DNA提取 用HPV DNA基因分型檢測(cè)試劑盒附帶的取樣拭子稍用力刮取患處皮損組織，放入專用的樣品保存管中，取脫落細(xì)胞保存液0.5 mL, 14000 r/m離心1 min，棄上清，使用DNA提取試劑盒在生物安全柜提取。提取后,取1 μL樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 HPV通用引物用于PCR擴(kuò)增，引物序列在5’端用生物素標(biāo)記，PCR產(chǎn)物也用生物素標(biāo)記。將23.25 mL PCR-MIX、0.75 mL Taq酶和1 μL DNA模板混合。同時(shí)設(shè)置了陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以控制操作造成的假陽(yáng)性或假陰性。ABI 2720擴(kuò)增儀PCR擴(kuò)增條件如下: UNG (Uracil DNA糖基化酶)酶在20℃處理10 min, 95℃預(yù)變性9 min, 95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng)5 min。

擴(kuò)增結(jié)束后95℃ 5 min變性。變性產(chǎn)物于核酸雜交儀上進(jìn)行雜交、孵育和顯色。按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交顯色及判讀結(jié)果。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陰性和陽(yáng)性對(duì)照均由試劑盒廠家提供。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。單一感染組和多重感染組中各基因亞型頻率用%表示，不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型以及不同危險(xiǎn)類(lèi)型的感染類(lèi)型的組間使用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV各亞型頻率分布 552例患者均來(lái)自濟(jì)寧、菏澤、棗莊縣市區(qū)，年齡最小者14歲，最大者82歲，平均年齡34歲(標(biāo)準(zhǔn)差12)。不同HPV亞型總計(jì)出現(xiàn)931次陽(yáng)性(含多重感染)，試劑盒包含的21種基因型均有檢出。低危型感染占比較高的基因型有：HPV6型196例(35.51%)和HPV11型131例(23.73%)；高危型感染占比較高的基因型有：HPV16型91例(16.49%)、HPV51型56例(10.14%)、HPV58型55例(9.96%)和HPV52型53例(9.60%)，見(jiàn)表1。單一感染和多重感染中HPV各亞型對(duì)比分析顯示，除了HPV6，其他型HPV多重感染均高于單一感染，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 HPV各亞型分布情況 例

圖1 單一感染和多重感染中HPV各基因型頻率分布

2.2 不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型 552例男性HPV感染者中，單純低危型感染占比為36.05%，單純高危型感染占比為32.79%，高低?；旌闲透腥菊急葹?1.16%，組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；HPV高危亞型感染占比高，占63.95%(單純高危型感染占比+高低?；旌闲透腥菊急?。

不同年齡組之間HPV感染占比總體比較，21～30歲組和31～40歲組的HPV感染占比最高(P<0.05)，分別為38.04%和28.80%。

不同感染類(lèi)型的各年齡段之間HPV感染占比比較，單純低危型中21～30歲組和31～40歲組感染占比最高(P<0.05)，分別為15.04%和11.41%，兩組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；單純高危型中21～30歲組和31～40歲組感染占比最高(P<0.05)，分別為11.41%和10.51%，兩組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；高低?；旌闲椭?1～30歲組的感染占比為11.59%，高于其它年齡組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同年齡段感染HPV的危險(xiǎn)類(lèi)型 例

2.3 不同HPV感染類(lèi)型分布 不同感染類(lèi)型中單一感染有314例，占56.88%，多重感染有238例，占43.12%，單一感染的占比高于多重感染(P<0.05)。隨著感染重?cái)?shù)的增加，單純低危型、單純高危型和高低?；旌闲偷母腥菊急染氏陆第厔?shì)(見(jiàn)圖2)，其中單一感染中，單純低危型占34.42%，單純高危型占22.46%，單純低危型感染占比高于單純高危型(P<0.05)；多重感染中，二重感染和三重感染的感染占比最高，分別為27.90%和9.24%，且高低危混合型組感染占比高于單純低危型組或單純高危型組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖2 不同感染類(lèi)型的感染占比分布情況

2.4 HPV結(jié)果與臨床聯(lián)系 552例男性HPV感染者中，根據(jù)臨床表現(xiàn)分為尖銳濕疣、亞臨床感染和鮑溫樣丘疹病，其臨床特征見(jiàn)表4和圖3。尖銳濕疣患者335例，占總病例數(shù)的60.69%，不同HPV亞型總計(jì)出現(xiàn)607次陽(yáng)性(含多重感染)，試劑盒包含的21種基因型均有檢出。主要感染亞型為HPV6、11、16、51型，分別為173例(51.64%)、119例(35.52%)、46例(13.73%)、29例(8.66%)。HPV6和11型感染占尖銳濕疣患者的87.16%。其中9例合并其他疾病，分別為梅毒4例，支原體感染、疥瘡、龜頭扁平苔蘚、股癬、銀屑病各1例。

亞臨床感染者210例，占總病例數(shù)的38.04%，不同HPV亞型總計(jì)出現(xiàn)315次陽(yáng)性(含多重感染)，試劑盒包含的21種基因型均有檢出。主要感染亞型為HPV16、52、58、51型，分別為41例(19.52%)、35例(16.67%)、30例(14.29%)、26例(12.38%)，均為高危型，以上4種亞型占亞臨床感染者的62.86%。其中11例合并其他疾病，梅毒1例，支原體感染3例，生殖器皰疹、陰莖珍珠樣疹、傳染性軟疣、念珠菌感染、尋常疣(下肢)、銀屑病、龜頭炎各1例。

7例鮑溫樣丘疹病患者中， HPV16型4例，余感染亞型分別為HPV6、11、43、51、68，各1例。高危型HPV16型感染占比高，占57.14%。

2.5 HPV結(jié)果與感染預(yù)防 結(jié)合魯西南地區(qū)男性HPV感染流行數(shù)據(jù)，我們計(jì)算了3種疫苗對(duì)本地區(qū)HPV覆蓋情況，見(jiàn)表5，552例男性感染者中，2價(jià)、4價(jià)、9價(jià)HPV疫苗覆蓋全部感染亞型的比例分別為6.34%、41.49%、54.53%；至少能覆蓋一種亞型的比例分別為20.47%、69.93%、83.51%。

表3 不同HPV感染類(lèi)型分布 例(%)

圖3 各類(lèi)患者HPV基因型頻率分布

表4 不同臨床診斷HPV感染特點(diǎn)及合并其他疾病情況

表5 3種疫苗對(duì)魯西南地區(qū)男性HPV感染者覆蓋情況

3 討論

HPV因其致癌性備受關(guān)注，高致癌風(fēng)險(xiǎn)的HPV持續(xù)感染可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在女性，由于系統(tǒng)的篩查和疫苗的預(yù)防接種，宮頸癌的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)[7]，然而，對(duì)于男性HPV感染，卻缺乏有效的篩查系統(tǒng)，且男性HPV疫苗的接種率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于女性。研究發(fā)現(xiàn)HPV相關(guān)的口咽鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of the oropharynx, OPSCC)的發(fā)病率在過(guò)去20年一直在上升，且大多數(shù)發(fā)生在65歲以內(nèi)的男性[8]。在皮膚性病學(xué)領(lǐng)域，HPV感染最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)是肛門(mén)生殖器疣，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染呈多重感染趨勢(shì)，且高低?；旌细腥緩V泛存在[3-6]，HPV有200余種亞型，且分布因地區(qū)而異。無(wú)論HPV感染后引起的口腔-生殖器腫瘤，還是肛門(mén)生殖器疣，都給患者乃至社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，接種疫苗是預(yù)防HPV感染主要手段，目前男性HPV疫苗接種仍未普及，因此，在實(shí)施疫苗接種計(jì)劃之前，研究該地區(qū)HPV類(lèi)型的流行和分布極為重要。

HPV感染存在地域差異性，我們的研究表明，魯西南地區(qū)552例男性HPV感染者中，以HPV6、11、16、51、58和52亞型感染常見(jiàn)，感染占比分別為35.51%、23.73%、16.49%、10.14%、9.96%和9.60%。曾成龍等[3]報(bào)道西安男性HPV感染最常見(jiàn)的亞型從高到低為6、11、16、43、42、52、59、58、51和11；薛耀華等[4]報(bào)道廣州地區(qū)HPV感染最常見(jiàn)的亞型為6、11、16、52 和58；戴永剛等[5]報(bào)道魯中地區(qū)HPV感染最常見(jiàn)的HPV亞型依次為11、6、52和16；呂家慶等[6]報(bào)道海南地區(qū)571例男性HPV感染者中，6、11、52、51、16是主要的感染亞型；以上表明，不同地區(qū)常見(jiàn)的HPV感染亞型有地域差異性，但均以HPV6、11、16亞型感染為主。這一結(jié)果為本地區(qū)男性HPV感染的防治提供了數(shù)據(jù)支持。

從總體人群來(lái)說(shuō)，于功奇等[9]報(bào)道，山東地區(qū)男性感染率與年齡無(wú)關(guān)，而我們的研究從已感染HPV的男性人群的角度得出，21～30歲組和31～40歲組的HPV感染占比居高，分別為38.04%和28.80%，此結(jié)果可能與21～40歲組男性為性活躍人群，接觸性伴多，導(dǎo)致這些人群感染占比偏高。因此盡早接種HPV疫苗，可以大規(guī)模阻斷HPV的傳播與感染。

本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，魯西南地區(qū)男性HPV感染者中，HPV高危亞型感染占比高，達(dá)63.95%(其中單純高危型感染占比為32.79%，高低?；旌闲透腥菊急葹?1.16%)。魯中地區(qū)報(bào)道的[5]男性患者HPV高危型感染占比達(dá)61.72%(其中單一高危型感染占比為10.04%，多重高危型感染占比為3.72%，高低危混合型感染占比為 47.96%)；海南地區(qū)[6]報(bào)道的571例男性HPV感染者中，HPV高危亞型感染占比為61.82%(其中單純高危型感染占比為34.15%，高低?；旌闲透腥菊急葹?7.67%)；以上地區(qū)男性HPV感染者中高危亞型感染占比均在60%以上。男性高危HPV持續(xù)感染往往會(huì)增加前列腺癌、肛門(mén)癌和口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)，尤其男男性接觸者的發(fā)病率明顯高于其他人[10-12]。男性是HPV病毒的“傳送者”，作為腫瘤相關(guān)的高危型HPV，在男性人群中以如此高的比例存在，不僅增加了自身癌變的潛在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也增加了其性伴侶的感染和癌變機(jī)率，從而嚴(yán)重威脅人群健康，值得警惕。這也為男性HPV疫苗接種以及新型多價(jià)HPV疫苗的研制提供依據(jù)。

本研究552例男性感染HPV患者中，尖銳濕疣占60.69%，主要感染亞型為6和11型，與指南[13]報(bào)道一致。亞臨床感染比例較高，占總感染數(shù)的38.04%，以高危型HPV感染為主，主要感染亞型為16、52、58、51型，占亞臨床感染者的62.86%，由于該人群發(fā)病隱匿，無(wú)自覺(jué)癥狀，極易造成病毒的播散，因此，亟需加強(qiáng)對(duì)該人群的監(jiān)測(cè)。鮑溫樣丘疹病是一種與HPV感染相關(guān)的性傳播疾病。大多數(shù)病變與致癌 HPV 類(lèi)型相關(guān)，主要是HPV16型，我們的研究與文獻(xiàn)報(bào)道一致。尖銳濕疣和亞臨床感染者，可同時(shí)由于通過(guò)性接觸傳播，HPV感染通常合并其他性傳播疾病，或銀屑病等疾病，這也為臨床治療HPV感染增加難度。

國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)應(yīng)用的HPV疫苗有3種：二價(jià)疫苗預(yù)防HPV16、18型感染，四價(jià)疫苗預(yù)防HPV6、11、16和18型感染，九價(jià)疫苗預(yù)防HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58型感染。結(jié)合魯西南地區(qū)男性HPV感染流行數(shù)據(jù)，我們計(jì)算了3種疫苗對(duì)本地區(qū)HPV覆蓋情況，見(jiàn)表5，與二價(jià)疫苗和四價(jià)疫苗相比，九價(jià)疫苗針對(duì)HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58，覆蓋本地區(qū)大多數(shù)最常見(jiàn)的HPV類(lèi)型(HPV6、11、16、51、58和52)，可能更適合魯西南地區(qū)。

本研究為單中心回顧性研究，且數(shù)據(jù)量相對(duì)不足，對(duì)研究結(jié)果可能造成偏倚，是本文局限性所在。綜上，通過(guò)本研究，初步預(yù)測(cè)魯西南地區(qū)男性HPV感染的流行病學(xué)特征，為未來(lái)男性HPV感染的防治、疫苗接種以及新型疫苗的研發(fā)提供流行病學(xué)依據(jù)。