呂兆豐，陳世珩，鄭添予，李百英，劉柏峰，劉伯軍*

1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林長春 130012；2.延邊大學(xué)，吉林延吉 133400；3.農(nóng)安縣動物疫病預(yù)防控制中心，吉林長春 130200

中國畜牧養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，但高速發(fā)展下，畜牧養(yǎng)殖廢水及糞便的排放污染已經(jīng)不容忽視，2019年，全國COD 排放總量中畜牧養(yǎng)殖污水占到45%，畜牧養(yǎng)殖業(yè)污水COD 排放量占到農(nóng)業(yè)源77%，并且畜牧養(yǎng)殖業(yè)污水中大量氨氮的排放，其總量占全國和農(nóng)業(yè)源的比例也高達24%和77%。值得注意的是，種類繁多的病原微生物存在養(yǎng)殖廢水中，例如糞大腸菌群、細菌總數(shù)、寄生蟲蟲卵等病原體等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的相關(guān)數(shù)據(jù)，目前已有大約200 種人畜共患傳染病，其污染程度嚴(yán)重的至少為90 種，這些共患病最主要的傳播途徑之一就是通過畜禽糞尿排泄物傳播到附近水體中。

世界范圍內(nèi)重點防范的介水傳播病原體之一的隱孢子蟲，已被世界衛(wèi)生組織將其列入重要腹瀉病原體之一。在畜牧養(yǎng)殖地區(qū)發(fā)病率明顯高于非畜牧養(yǎng)殖地區(qū)[1]。目前國際上常用的隱孢子蟲檢測標(biāo)準(zhǔn)方式是由美國國家環(huán)?？偩?USEPA) 制定并發(fā)布的1 623 種方法，但方法存在成本高、回收率低且不穩(wěn)定等缺陷[2]。另外, 這些方法的參數(shù)是根據(jù)飲用水的品質(zhì)來設(shè)定的，當(dāng)它適用于環(huán)境樣品和養(yǎng)殖廢水時，有一定的不確定性。因此，本研究建立“膜過濾-蔗糖密度梯度離心”法濃縮純化及免疫熒光檢測隱孢子蟲的方法，對長春市周邊5 個養(yǎng)殖場的廢水中隱孢子蟲污染狀況進行調(diào)查，以期為隱孢子蟲病的防治和介水傳播風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 水樣采集

在長春市肉牛養(yǎng)殖密集的郊區(qū)選擇5 家中小規(guī)模養(yǎng)牛場進行取樣調(diào)查。樣品采集為養(yǎng)殖場集水池，液面10 ～15 cm 處液體，每個采樣點共采集樣品10 L，在10 個不同位置進行采集，每1 L 為一個樣品，共計100 個水樣。采好的水樣，放置冷藏盒暫存，在5 h 內(nèi)送往實驗室，放于-4 ℃冰箱暫時冷藏，參考車逍宇[3]提出的污水細菌技術(shù)方法，2 ～3 d內(nèi)完成對采集到水樣的水質(zhì)、細菌和糞大腸菌群等分析。

1.2 隱孢子蟲卵囊的純化

采集的水樣經(jīng)過濾處理，濾膜為1 μm 孔徑，濾膜上隱孢子蟲和其它雜質(zhì)被截留，丙酮溶解濾膜在20 ℃、2 000 g條件下離心10 min，吸掉上層離心液，再添加40 mL 丙酮相同條件下再次離心，吸掉上層離心液，底層沉淀添加5 mL 乙醇，輕輕混勻，再緩慢加入少量去離子水40 mL，20 ℃、2 000 g 條件下離心10 min，離心完成后去掉上清液。5 mL 的PBS 與沉淀用渦旋振蕩器振蕩混勻2 min。分別配置1:1 蔗糖溶液和1:2 蔗糖溶液，取1:1 蔗糖溶液20 mL，濃縮后的沉淀液5 mL，20 mL 1:2 蔗糖溶液依次緩慢加入到50 mL 離心管中，3 500 r/min 離心上述50 mL 離心管15 min，離心完成后可觀察到離心管中的液體出現(xiàn)分層，依次為水層、卵囊層、蔗糖溶液層和沉淀雜質(zhì)，卵囊層移至離心管中，PBS進行稀釋，稀釋比例為1:4，3 500 r/min, 離心15 min，收集卵囊沉淀。

1.3 染色鏡檢

通過免疫熒光分析進一步檢測隱孢子蟲卵囊[4]，按試劑盒說明書進行熒光染色和DAPI 染色。染色過程如下：在井形玻片放置純化后的樣品，玻片干燥后，使用50 μL 甲醇干燥固定；井形玻片加入DAPI 50 μL，保持2 min，棄上層液體，用蒸餾水清洗，加入50 μL Easy StainTM 熒光抗體染色試劑，井形玻片避光濕盒室溫培養(yǎng)30 min，棄上層液體，緩慢加入300 μL 冷凍的固定緩沖液，保持2 min 傾斜，棄上層液體，加入10 μL 封固劑后加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。在400 倍FITC 模式下觀察，發(fā)現(xiàn)邊緣呈蘋果綠色目標(biāo)物后轉(zhuǎn)換至DAPI模式，當(dāng)FITC 與DAPI 染色特征均符合染色特征時，在1 000 倍油鏡下進一步對目標(biāo)物確認(rèn)，并全井計數(shù)。

1.4 方法驗證和質(zhì)量控制

通過純水加標(biāo)試驗，確定驗證方法可行性。隱孢子蟲標(biāo)樣100 個左右加入10 L 水中，進行富集、分離、染色和鏡檢，以上步驟按照實驗水樣處理步驟。依據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》的要求，陽性隱孢子蟲回收率為10%～100%，空白對照不得檢出隱孢子蟲卵囊。

2 結(jié)果

2.1 長春郊區(qū)的規(guī)模養(yǎng)牛場廢水水質(zhì)調(diào)查

5 家養(yǎng)牛場中分別有3家干清糞場和2 家水沖糞場。常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)濃度變化情況詳見表1。目前干清糞工藝小規(guī)模養(yǎng)牛場清糞程度不高，污水的有機物濃度和SS 濃度均較高，廢水常規(guī)指標(biāo)采用干清糞方式的養(yǎng)殖場廢水比水沖糞方式養(yǎng)殖場廢水高3～5 倍。

表1 4 家養(yǎng)殖場常規(guī)指標(biāo)濃度

2.2 隱孢子蟲純化鏡檢結(jié)果

在熒光顯微鏡藍光激發(fā)下孢囊壁發(fā)出蘋果綠色熒光，當(dāng)蘋果綠色目標(biāo)物DAPI 染色特征呈現(xiàn)邊緣綠色，內(nèi)部淺藍色時，DAPI 染色為陰性，當(dāng)內(nèi)部呈現(xiàn)深藍色染色特征或者觀察到1 ～4 個細胞核時，DAPI 染色為陽性。

2.3 質(zhì)量控制

通過陽性質(zhì)控和陰性對照檢測，結(jié)果顯示：隱孢子蟲陽性質(zhì)控的回收率為17.0%～24.5%之間，符合GB/T5750．12-2006 的基本要求，檢測結(jié)果中空白對照組均為陰性。說明本實驗檢測隱孢子蟲分析結(jié)果可信。

2.4 養(yǎng)殖廢水中隱孢子蟲檢測結(jié)果

從5 個養(yǎng)殖場集水池中，96%的樣本（48/50）檢測到隱孢子蟲活卵囊，平均密度為41.56 個/L卵囊（范圍為1 ～44 個/L 卵囊）。先前的研究報告了養(yǎng)殖場集水池卵囊計數(shù)的類似結(jié)果[5]。

表2 養(yǎng)殖廢水中細菌總數(shù)，糞大腸菌群數(shù)和隱孢子蟲卵囊檢出情況

3 討論

本次調(diào)查的5 家中小規(guī)模養(yǎng)牛場均位于郊區(qū)附近，對其排水均未采取任何特殊處理措施。隱孢子蟲作為人畜共患的介水傳染病的病原體之一，在畜牧發(fā)達地區(qū)主要傳播方式就是通過糞便污染水源得以傳播，至今吉林省畜牧廢水中隱孢子蟲的感染狀況未見報道。此次調(diào)查結(jié)果表明：養(yǎng)殖業(yè)及禽畜加工業(yè)廢水中含有的致病性原蟲卵囊數(shù)量較多，未進行針對性處理去除，地表水受到原蟲污染，主要途徑為致病性原蟲隨雨水徑流進入水源，之后深度擴散有待進一步追蹤污染源調(diào)查。此次檢測建立的“膜過濾-蔗糖密度梯度離心”法濃縮純化及免疫熒光檢測隱孢子蟲，隱孢子蟲回收率為17.0%～24.5%之間，符合GB/T5750．12-2006 的基本要求，成本降低，能運用于實際檢測中。吉林省是畜牧業(yè)發(fā)展重點地區(qū)，澇壩水（低洼地積水）處飲用水的水源很容易被污染[6]，對控制用水安全有重要意義。