李春花，李忠新，張春雷，曾學(xué)輝，陳甜甜，宋林立

在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)發(fā)病早期，由于臨床表現(xiàn)不明顯，極易被忽略，導(dǎo)致病情進(jìn)展。若未能及時(shí)接受治療，CHB患者病情可進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)或終末期肝病[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分CHB患者存在程度不一的肝纖維化，早期積極干預(yù)可有效逆轉(zhuǎn)病變[3-5]，故及早評(píng)估CHB患者肝纖維化程度可為臨床干預(yù)提供指導(dǎo)，有效改善預(yù)后。臨床上，針對(duì)CHB患者肝纖維化程度的判斷多依賴于肝穿刺組織學(xué)檢查[6]，但肝活檢操作本身具有創(chuàng)傷性，可重復(fù)性差，且容易受取樣誤差等因素影響結(jié)果，在實(shí)際應(yīng)用中面臨一定的限制。故探尋無創(chuàng)、操作性強(qiáng)、可重復(fù)性好且準(zhǔn)確性良好的評(píng)估手段已成為臨床相關(guān)研究的重點(diǎn)。血清學(xué)標(biāo)志物作為一類非創(chuàng)傷性檢測(cè)指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷。成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factors-21，F(xiàn)GF-21)作為近年來被發(fā)現(xiàn)的一類分泌性蛋白，由肝臟細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并以肝臟為靶器官，發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[7]，可有效降低肝損傷，但有關(guān)其與肝纖維化關(guān)系方面的研究仍較少。血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的有絲分裂原，被認(rèn)為可能參與肝纖維化進(jìn)展過程[8]。纖維蛋白(fibrosin，F(xiàn)BRS)系一類由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有一定的促纖維化作用[9]。本研究檢測(cè)了不同肝纖維化程度的CHB患者血清這些細(xì)胞因子的水平變化，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年1月～2021年1月我院收治的CHB患者92例，男性61例，女性31例；年齡為21～53歲，平均年齡為(34.3±8.5)歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并甲型、丙型肝炎病毒或HIV感染者；(2)自身免疫性、藥物性、酒精性肝病患者；(3)合并惡性腫瘤、嚴(yán)重的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾病者；(4)妊娠期或哺乳期婦女。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 肝活檢 患者取左側(cè)臥位或平臥位，在超聲導(dǎo)引下行肝穿刺檢查，取出肝組織，固定于10%甲醛溶液內(nèi)、送檢。按照《肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)》[11]進(jìn)行肝纖維化分期評(píng)估，非顯著性肝纖維化為S0～1期，顯著性肝纖維化為S2～4期，其中S0期為無纖維化表現(xiàn)；S1期為存在匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，纖維化僅局限于竇周和小葉內(nèi)；S2期為匯管區(qū)周圍發(fā)生纖維化，伴隨纖維間隔產(chǎn)生，保留小葉結(jié)構(gòu)；S3期為形成纖維間隔，出現(xiàn)小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4期為早期肝硬化。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 采集空腹外周靜脈血4ml，分為2份，其中1份及時(shí)分取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清FGF-21和PDGF-BB水平(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；使用南京貝登醫(yī)療股份有限公司生產(chǎn)的邁瑞B(yǎng)S-280型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)，計(jì)算肝纖維化指數(shù)-4(fibrosis-4，F(xiàn)IB-4)=年齡×AST/(血小板計(jì)數(shù)×ALT1/2)；使用邁瑞B(yǎng)C-5000型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)；使用全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)血清HBsAg和HBeAg(美國Abbott公司)；使用德國羅氏公司Light Cycler熒光定量PCR儀檢測(cè)血清HBV DNA(深圳匹基生物工程股份有限公司)；采用放射免疫法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen，ⅣC)和Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ，廈門波生生物技術(shù)有限公司)；對(duì)另一份血液標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定FBRS mRNA水平，具體步驟如下：采用Ficoll-Hyapque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，加入Trizol試劑提取總RNA，使用NanoDrop 2000微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，置入-80°冰箱凍存?zhèn)溆?。?yīng)用Primer Premier 5.0基因設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)BRS正向引物序列：5'-CCTGCCTTCCGGGGCCCTAT-3'，反向引物序列：5'-TGGGGCCCCTGGGCTTTCTT-3'。PCR反應(yīng)體系：dd H2O 32.5μl，10×LA PCR Buffer 5μl，dNTP Mixture(10mM) 8 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，TakaRa LA Taq 6 μl，總反應(yīng)體系為50 μl。PCR反應(yīng)設(shè)定：預(yù)變性：95℃ 3 min，PCR擴(kuò)增：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 90 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，延伸：72 ℃ 10 min，冷卻：16℃ 10 min。將GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算FBRS mRNA相對(duì)水平。

1.4 肝臟硬度檢測(cè)(LSM) 使用法國EchoSens公司提供的Fibroscan檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)檢查情況 經(jīng)肝組織病理學(xué)檢查，在92例CHB患者中，發(fā)現(xiàn)S0期12例，S1期37例，S2期16例，S3期15例，S4期12例，其中非顯著性肝纖維化組49例，顯著性肝纖維化組43例。

2.2 兩組基線資料比較 顯著性肝纖維化組血清AST、ALT、FIB-4、LSM、LN、PCⅢ、PDGF-BB和PBMCs FBRS水平均顯著高于非顯著性肝纖維化組(P<0.05)，而血清FGF-21水平顯著低于非顯著性肝纖維化組(P<0.05，表1)。

表1 兩組基線資料比較

2.3 FGF-21、PDGF-BB和FBRS診斷CHB患者顯著性肝纖維化的效能分析 四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的效能顯著高于各單項(xiàng)指標(biāo)(表2、圖1)。

表2 各指標(biāo)診斷CHB患者顯著性肝纖維化的效能

圖1 各指標(biāo)診斷CHB患者顯著性肝纖維化的ROC曲線

3 討論

肝纖維化為多種致病因素作用下肝內(nèi)纖維組織異常增生的病理學(xué)過程。若肝損傷、肝細(xì)胞炎癥壞死等致病因素持續(xù)存在，則肝纖維化將持續(xù)存在，直至出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)改變、假小葉形成，形成早期肝硬化[12-14]。肝纖維化屬于機(jī)體面對(duì)肝臟炎癥的一種修復(fù)反應(yīng)，但其過度增生可使肝小葉結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，阻礙局部淋巴回流和血液流通，從而導(dǎo)致門脈高壓癥。雖然造成肝細(xì)胞損傷的因素較為復(fù)雜，但肝纖維化的形成主要與肝星狀細(xì)胞(HSC)相關(guān)[15,16]。在HSC異常激活的情況下，細(xì)胞外基質(zhì)可被大量分泌，同時(shí)參與降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶活性降低或合成減少，導(dǎo)致肝內(nèi)纖維基質(zhì)沉積增多，而在這一過程中各種細(xì)胞因子發(fā)揮了重要的作用。本研究結(jié)果顯示，顯著性肝纖維化患者肝損傷更為明顯，血清FGF-21水平顯著低于非顯著性肝纖維化組。FGF21屬于一類脂肪細(xì)胞因子，在正常情況下由肝臟脂肪細(xì)胞分泌，可參與調(diào)節(jié)胰島素敏感性，降低胰島素抵抗并減少脂肪變性，進(jìn)而增加能量消耗。當(dāng)CHB患者發(fā)生脂質(zhì)代謝異常時(shí)，可引起細(xì)胞外基質(zhì)合成途徑改變，促進(jìn)HSC活化，加重肝纖維化，而此時(shí)FGF21可通過對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制改善對(duì)乙酰氨基酚造成的肝損傷。同時(shí)，它可參與抑制HSC活化，減輕肝纖維化程度[17]。隨著CHB患者病情持續(xù)進(jìn)展，循環(huán)FGF21由最初的代償性升高逐漸演變?yōu)榉置诓蛔?，肝纖維化程度可進(jìn)一步加重。

HBV感染系肝纖維化的常見誘因，肝臟可出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性損傷，出于機(jī)體自身修復(fù)反應(yīng)，肝臟局部纖維組織可發(fā)生顯著增生。雖然肝組織病理性檢查可作為肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有創(chuàng)傷性，慢性肝病患者接受檢查的依從性較差。目前，臨床上常用的肝損傷血清指標(biāo)在評(píng)估肝纖維化時(shí)往往容易受局部炎癥反應(yīng)的影響，診斷效能不高。相關(guān)研究指出，肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)為HSC激活、細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌[18]，而期間各類細(xì)胞因子對(duì)HSC的調(diào)節(jié)、活化作用以及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解平衡均可參與肝纖維化的發(fā)生過程。在本研究，顯著性肝纖維化組血清PDGF-BB和PBMCs FBRS mRNA水平顯著高于非顯著性肝纖維化組，經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB和FBRS診斷CHB患者顯著性肝纖維化的AUC分別為0.714和0.690，診斷的敏感度和特異度分別為69.8%和69.4%及65.1%和73.5%。當(dāng)上述指標(biāo)與FGF-21和LSM聯(lián)合診斷時(shí)，其AUC可達(dá)到0.989，敏感度和特異度分別為95.3%和63.3%，提示聯(lián)合多種指標(biāo)診斷CHB患者顯著性肝纖維化具有良好的效能，但其特異度還不夠高。PDGF-BB屬于HSC的有絲分裂原。當(dāng)CHB患者發(fā)生肝纖維化時(shí)，HSC、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞在慢性炎癥刺激下可生成并分泌PDGF-BB，而PDGF-BB可進(jìn)一步與HSC所表達(dá)的受體結(jié)合，刺激HSC活化和增殖[19,20]，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。FBRS可經(jīng)由成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在CHB患者肝損傷和肝纖維化進(jìn)展過程中，受炎癥刺激而活化的HSC和淋巴細(xì)胞均可合成并分泌FBRS，而FBRS可進(jìn)一步刺激HSC活化、膠原分泌和成纖維細(xì)胞增殖，從而加重肝纖維化程度。