王廣麗，徐 歡，董丹丹，黃 荷

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是因乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持續(xù)感染而致的肝臟慢性疾病，恩替卡韋等抗病毒藥物是治療CHB的主要藥物。因抗病毒藥物發(fā)展迅速、用藥方案的多元化增加，HBV耐藥突變株出現(xiàn)的概率也大大增加[1]。HBV在自然選擇、宿主免疫力等多重因素作用下易產(chǎn)生耐藥突變，進(jìn)而影響抗病毒的治療效果，導(dǎo)致病情反復(fù)，使疾病的治療變得困難[2]。HBV復(fù)制需要逆轉(zhuǎn)錄過程，因其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏糾錯能力，容易發(fā)生病毒基因變異，產(chǎn)生變異株的幾率遠(yuǎn)高于其他DNA病毒，而HBV基因組各讀碼框架間為編碼基因共用，增加了變異株發(fā)生的機(jī)會[3]。相關(guān)研究也指出，耐藥變異株的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了CHB患者的治療效果[4,5]，故研究HBV耐藥基因型分布特征及耐藥突變模式，對于減少耐藥事件的發(fā)生，提高臨床治療療效至關(guān)重要，但目前對于HBV恩替卡韋耐藥基因的研究尚處于探索階段。本研究旨在探究HBV恩替卡韋耐藥基因突變模式和新型rtL180M/A186T/M204V突變株表型的發(fā)生規(guī)律，以為更精準(zhǔn)地治療CHB患者提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年10月～2020年10月我院收治的CHB患者107例，男64例，女43例；年齡為31～58歲，平均年齡為(45.3±4.7)歲。CHB診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入患者為拉米夫定、恩替卡韋或阿德福韋聯(lián)合恩替卡韋經(jīng)治患者，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)惡性腫瘤；(2)合并丙型肝炎病毒、人體免疫缺陷病毒感染者；(3)存在酒精性肝病或自身免疫性肝病。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，患者簽署入組知情同意書。典型病例治療情況：患者女性，47歲，于2009年7月被診斷為CHB，先后接受拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋聯(lián)合恩替卡韋或替諾福韋治療。在接受抗病毒治療前，病毒準(zhǔn)種池克隆顯示為100%野生株(WT)，經(jīng)拉米夫定治療23個月時血清HBV DNA由2.0 lg IU/ml突破至6.94 lg IU/ml，病毒準(zhǔn)種池顯示為95% rtS202G突變和5% rtT184突變，隨后換用恩替卡韋或阿德福韋聯(lián)合恩替卡韋治療，發(fā)現(xiàn)5% rtT184突變逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?0%優(yōu)勢病毒株，同時還檢測出10%rtS202G/M204V/L180M突變，最后更換為替諾福韋治療4個月后檢測，發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA低于檢測下限。

1.2 HBV RT區(qū)基因突變分析 使用病毒DNA OUT試劑(北京天恩澤公司)提取血清HBV DNA，應(yīng)用巢氏PCR法進(jìn)行HBV RT基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃ 180 s、94℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 60 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，72℃延伸120 s。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行電泳鑒定，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA雙向測序，分析rt184、rt202和rt250等經(jīng)典恩替卡韋和拉米夫定耐藥相關(guān)位點(diǎn)及rt180位點(diǎn)突變情況，應(yīng)用MEGA4軟件分析鑒定基因型。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 使用質(zhì)粒小量提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，選擇受試者HBV RT野生株和rtS202G/M204V/L180M突變株菌液小量抽提質(zhì)粒。應(yīng)用核酸內(nèi)切酶(美國Promega公司)，經(jīng)雙酶切后將RT區(qū)片段連接至pTriEx-HBV1.1倍載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，接種于含100 μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱過夜，行克隆測序，制備轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒備用。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒復(fù)制力分析 使用Plasmid Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，每孔加入0.25 μg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染4 h，更換DMEM，并向培養(yǎng)液中加入0.0、0.001、0.01、0.1、1.0和10.0 μmol/L恩替卡韋或拉米夫定、阿德福韋、替諾福韋，每2天更換為含有相應(yīng)藥物濃度的新培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)4 d，收集細(xì)胞上清液，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測HBV DNA載量，以無藥物壓力培養(yǎng)細(xì)胞上清HBV DNA水平代表病毒復(fù)制力水平。

2 結(jié)果

2.1 恩替卡韋耐藥基因檢出情況 在本組107例CHB患者中，恩替卡韋耐藥基因rtS202G/M204V/L180M檢出率顯著高于其他耐藥基因型(P<0.05，表1)。

表1 恩替卡韋耐藥基因檢出率(%)情況

2.2 恩替卡韋耐藥患者核苷(酸)類藥物抗病毒治療史情況 恩替卡韋耐藥患者應(yīng)用過拉米夫定治療者顯著高于阿德福韋治療者(P<0.05，表2)。

2.3 不同恩替卡韋耐藥基因患者血清HBV DNA水平比較 基因型為rtS202sub和rtM250sub患者血清HBV DNA水平顯著低于其他兩型(P<0.05，表3)。

表2 恩替卡韋耐藥患者核苷(酸)類藥物抗病毒治療史(%)情況

表3 不同恩替卡韋耐藥基因患者血清HBV DNA水平比較

2.4 不同病毒株轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清HBV DNA載量比較 rtS202G/M204V/L180M突變株恩替卡韋培養(yǎng)上清HBV DNA水平顯著高于rtT184A/M204V/L180M突變株(P<0.05)，而兩種病毒株經(jīng)替諾福韋作用培養(yǎng)上清HBV DNA水平無顯著性差異(P>0.05，表4)。

表4 不同病毒株轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清HBV DNA載量比較

3 討論

臨床上，采用核苷(酸)類藥物治療CHB患者可通過抑制病毒復(fù)制起到改善肝功能的作用，但基因型耐藥的出現(xiàn)可直接影響治療效果，導(dǎo)致臨床治療的失敗[7,8]。HBV是部分雙鏈DNA病毒，其復(fù)制是由多聚酶通過RNA中間體完成的。由于缺乏校讀功能，在長期使用核苷(酸)類似物治療過程中會導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)[9,10]。恩替卡韋因具有較強(qiáng)的抗病毒效力，且能抑制肝組織學(xué)病變。恩替卡韋治療時主要抑制的是病毒逆轉(zhuǎn)錄過程，而不能抑制細(xì)胞核中已形成的HBV cccDNA[11,12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋初治患者中長期治療的耐藥發(fā)生率較低，而對拉米夫定耐藥患者使用恩替卡韋治療后，其耐藥發(fā)生率顯著增加[13,14]，可能與拉米夫定具有交叉耐藥性有關(guān)。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋對于拉米夫定耐藥突變株有明顯的選擇壓力，患者在接受拉米夫定治療失敗后，再予以恩替卡韋治療，出現(xiàn)耐藥株的概率大大增加[15]。本研究對患者抗病毒治療史進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)恩替卡韋耐藥患者曾應(yīng)用拉米夫定治療者較多，提示經(jīng)拉米夫定治療后患者對恩替卡韋耐藥率也會增加，可能是因?yàn)槔追蚨退幓颊卟《綝NA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄區(qū)出現(xiàn)突變，會使病毒復(fù)制力增加，再給予恩替卡韋治療時，可能會出現(xiàn)病毒學(xué)突破，進(jìn)而增加恩替卡韋耐藥的危險性。

不同HBV基因型的致病性和對核苷(酸)類藥物治療的反應(yīng)差別較大。通過分析患者耐藥基因可有助于改進(jìn)后續(xù)治療方法，進(jìn)而可起到提高臨床治療效果、改善預(yù)后的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，在恩替卡韋耐藥基因中，rtS202G/M204V/L180M檢出率顯著高于其他基因型，說明rtS202G/M204V/L180M為恩替卡韋的主要耐藥基因。病毒發(fā)生變異與病毒復(fù)制水平有關(guān)，核苷類似物可抑制病毒復(fù)制，而無法起到清除病毒的作用。如藥物能完全抑制病毒復(fù)制，其對病毒施加了更明顯的選擇壓力，其產(chǎn)生耐藥的概率就會降低[17,18]。本研究結(jié)果顯示，基因型為rtS202sub患者血清HBV DNA水平顯著低于rtT184sub、rtM250sub、rtT184/S202sub感染者，說明不同突變株對藥物的敏感性不同。

抗病毒藥物治療CHB患者可有效抑制病毒復(fù)制，減輕肝臟炎癥活動，延緩疾病進(jìn)展，但HBV獨(dú)特的復(fù)制機(jī)制使得患者在接受長期持久的抗病毒治療后，大大增加了耐藥突變株產(chǎn)生的風(fēng)險[19,20]。對核苷(酸)類耐藥患者中HBV逆轉(zhuǎn)錄酶耐藥模式較多，耐藥患者出現(xiàn)了病毒學(xué)反跳或治療效果不理想[21]，提示除了已發(fā)現(xiàn)的耐藥基因型外，可能還存在某些新的變異位點(diǎn)。M204V為拉米夫定耐藥的主要突變位點(diǎn)，其可大大降低病毒對拉米夫定的敏感性，而恩替卡韋的耐藥突變可建立在拉米夫定耐藥變異之上[22]。本研究對rtM204V陽性患者進(jìn)行直接測序，結(jié)果顯示患者均存在rtA186T/L180M突變，提示rtS202G/M204V/L180M或可同時出現(xiàn)。病毒的適應(yīng)力是指病毒在特定環(huán)境中的復(fù)制能力，即突變病毒株在無藥物存在下相對于野生株的復(fù)制能力。本研究發(fā)現(xiàn)，rtS202G/M204V/L180M 突變株的復(fù)制力較強(qiáng)，可能與該變異株進(jìn)入病毒生命周期中獨(dú)特的cccDNA池有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同病毒突變株均對替諾福韋敏感，為耐藥患者的挽救治療提供了一種選擇。