李永軍，王雅杰

（1.廣州微遠(yuǎn)基因科技有限公司，廣東 廣州 510663；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100015）

藥物敏感性試驗(yàn)為臨床對(duì)于細(xì)菌選擇有效抗生素提供了重要依據(jù)。隨著細(xì)菌對(duì)抗生素藥物耐藥性的不斷加劇，既往的經(jīng)驗(yàn)治療方案在臨床應(yīng)用時(shí)已經(jīng)顯得能力不足，無(wú)法得到預(yù)期的臨床效果。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是基于微生物培養(yǎng)鑒定確認(rèn)后才進(jìn)行檢測(cè)，通常會(huì)耗時(shí)3～4 d，對(duì)臨床早期精準(zhǔn)抗感染存在一定局限，無(wú)法為臨床在早期的治療中提供有效的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。因此，基于標(biāo)本或菌株的耐藥基因單重/多重多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)目前正在應(yīng)用于臨床，為快速診斷提供有力的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)支撐。

目前已有商業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用到了臨床，如Unyvero在對(duì)呼吸道常見(jiàn)病原體鑒定的同時(shí)納入10種耐藥基因?yàn)榕R床用藥提供指導(dǎo)，有助于提高呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（ICU VAP）與醫(yī)院獲得相關(guān)性肺炎（HAP）患者的早期精準(zhǔn)診斷并減少?gòu)V譜抗生素的使用[1]；Xpert Carba-R Assay碳青霉烯耐藥基因檢測(cè)試劑為感控監(jiān)測(cè)提供解決方案，可以1 h內(nèi)對(duì)急診患者進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌進(jìn)行篩查并指導(dǎo)感控舉措[2]；最新升級(jí)的Filmarray的血培養(yǎng)鑒定panel包含了11種常見(jiàn)的耐藥基因，比第一版血培養(yǎng)鑒定panel 檢測(cè)更多的細(xì)菌與耐藥基因，甚至也拓展至VAP患者肺泡灌洗液檢測(cè)[3-4]。但因臨床患者不同病程背景的多元化體現(xiàn)及隨時(shí)變化的病情，商業(yè)化產(chǎn)品可能無(wú)法滿(mǎn)足臨床醫(yī)生的實(shí)際需求，因此這就要求臨床實(shí)驗(yàn)室提供新的解決方案以應(yīng)對(duì)臨床的實(shí)際需求。

1 現(xiàn)狀

近年來(lái)基于NGS的新技術(shù)病原宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next generation sequencing, mNGS）在臨床疑難、危重、特殊感染患者病原體診斷層面發(fā)揮了巨大作用[5]。mNGS因無(wú)需培養(yǎng)，無(wú)偏好性的特點(diǎn)，不僅覆蓋微生物的基因組，也可覆蓋攜帶耐藥/毒力基因的質(zhì)粒。因此，通過(guò)將測(cè)序后的大數(shù)據(jù)(去除人源序列后的微生物核酸序列)與耐藥/毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)（CARD/ResFinder/ MEGARes/VFDB等）進(jìn)行比對(duì)，可以實(shí)現(xiàn)部分入組患者的耐藥/毒力基因分析[6]。在鑒定出耐藥菌的同時(shí)，分析耐藥基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)部分患者診療指導(dǎo)是現(xiàn)階段mNGS臨床應(yīng)用的一個(gè)細(xì)化方向。

EUCAST（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Test）在2017年公布了兩份文件，文件中對(duì)基因組測(cè)序技術(shù)在推斷抗微生物藥物敏感性的應(yīng)用中將其描述為“根據(jù)臨床折點(diǎn)評(píng)估基因型數(shù)據(jù)是一項(xiàng)更艱巨的挑戰(zhàn)，但如果基于基因組測(cè)序的測(cè)試要指導(dǎo)臨床決策制定，這將是必要的[7-8]?！辈⒃谖募羞M(jìn)行了對(duì)測(cè)序技術(shù)的先進(jìn)性及局限性進(jìn)行了描述，從報(bào)告中可以看出在當(dāng)時(shí)EUCAST就對(duì)于測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到病原微生物耐藥性檢查中應(yīng)用前景有著很大的期待。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI）自2019年發(fā)布的臨床藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)（M100 Ed29）中提出了利用分子生物學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)菌的耐藥基因用以幫助臨床進(jìn)行抗感染治療[9-12]。其中涉及到了多種臨床常見(jiàn)的耐藥菌株的耐藥基因，包括如mecA、PBP2a、vanA、vanB、及碳青霉烯酶等臨床常見(jiàn)耐藥菌株的耐藥基因，同時(shí)給出了對(duì)每一個(gè)耐藥基因的詳細(xì)注釋。2020年，魯辛辛等發(fā)布的《高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專(zhuān)家共識(shí)》提到mNGS的臨床應(yīng)用的適應(yīng)性，并且提出了不同類(lèi)型臨床標(biāo)本的前處理方法。在mNGS的整個(gè)應(yīng)用全程中提出了11點(diǎn)建議[13]。2021年，王輝等發(fā)布的《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》指出，感染發(fā)生在正常無(wú)微生物定植的部位且標(biāo)本采集過(guò)程污染概率低時(shí)，可以考慮采用mNGS進(jìn)行物種鑒定的同時(shí)檢測(cè)耐藥基因，并通過(guò)耐藥表型試驗(yàn)對(duì)耐藥基因進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)有菌種特異性的耐藥基因，在測(cè)序深度足夠時(shí)，可以考慮應(yīng)用mNGS檢測(cè)獲得性的耐藥基因，預(yù)測(cè)耐藥表型[14]。雖然在該共識(shí)中，對(duì)“mNGS檢測(cè)耐藥基因的解讀”采用了很謹(jǐn)慎的語(yǔ)句，如“正常無(wú)微生物定植的部位”或“有菌種特異性的耐藥基因”，但為mNGS耐藥基因報(bào)告提供了指引方向。

然而，現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)不一，對(duì)耐藥基因不加篩選，一份報(bào)告許多種耐藥基因提示臨床幾乎所有可選用的藥物都耐藥，或者在沒(méi)有患者詳細(xì)基礎(chǔ)信息的情況下，直接指導(dǎo)臨床藥物選擇，對(duì)mNGS規(guī)范化臨床應(yīng)用產(chǎn)生誤導(dǎo)。面對(duì)mNGS分析比對(duì)后檢出諸多耐藥基因如何報(bào)告及如何解讀的問(wèn)題，筆者綜合現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報(bào)告現(xiàn)狀及臨床實(shí)踐，從報(bào)告和解讀層面提出了以下要點(diǎn)，供臨床醫(yī)生參考。

2 報(bào)告要點(diǎn)

①通過(guò)與耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，應(yīng)用mNGS可以對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)中是否存在耐藥基因進(jìn)行分析。建議需要依據(jù)耐藥基因臨床重要性進(jìn)行選擇性報(bào)告，不建議對(duì)mNGS檢出的耐藥基因不加篩選和分析，報(bào)告多種甚至數(shù)百種耐藥基因。耐藥基因應(yīng)在充分調(diào)研現(xiàn)有分子耐藥檢測(cè)產(chǎn)品、征詢(xún)臨床意見(jiàn)、大數(shù)據(jù)分析（如判斷是否背景來(lái)源）等多維情況進(jìn)行選擇與報(bào)告。

以耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD為例，其涵蓋數(shù)千個(gè)耐藥基因。然而，數(shù)千個(gè)耐藥基因的臨床意義有限，耐藥機(jī)制未明或臨床意義未明的耐藥基因占比絕大部分，比如數(shù)年前某項(xiàng)研究報(bào)道北京一次霧霾天的14份空氣樣本中檢測(cè)出60余種耐藥基因，引起公眾恐慌。而略知臨床微生物知識(shí)學(xué)者都明白，抗性基因顯然與人體對(duì)某種耐藥微生物感染是不能直接掛鉤[15]。因此，耐藥基因檢測(cè)需要關(guān)注臨床重要耐藥菌，尤其關(guān)注包括“ESKAPE”在內(nèi)的常見(jiàn)耐藥菌及其對(duì)應(yīng)的有菌種特異性的耐藥基因，其它病原體諸如百日咳桿菌、軍團(tuán)菌、支原體等耐藥情況相對(duì)少見(jiàn)，并不需要或現(xiàn)階段并不需要開(kāi)展耐藥基因檢測(cè)[16]。

②因宏基因組方法廣覆蓋的特點(diǎn)，來(lái)自臨床的原始樣本如肺泡灌洗液常檢出多種病原體。檢出耐藥基因的來(lái)源判斷存在挑戰(zhàn)，與已有呼吸道檢測(cè)panel耐藥基因報(bào)告邏輯相同，建議在耐藥菌檢出的情況下進(jìn)行耐藥基因報(bào)告，沒(méi)有目標(biāo)耐藥菌檢出的情況下，不進(jìn)行耐藥基因報(bào)告。同時(shí)對(duì)于樣本中微生態(tài)菌群、檢測(cè)過(guò)程、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等方面來(lái)源的耐藥基因，需要基于陰性對(duì)照樣本及臨床報(bào)告陰性的大數(shù)據(jù)樣本建立耐藥基因報(bào)告閾值。

例如Unyvero呼吸道樣本檢測(cè)panel對(duì)呼吸道樣本如肺泡灌洗液檢測(cè)，涵蓋20余種常見(jiàn)的呼吸道感染病原體與10種耐藥基因。在一項(xiàng)多中心的性能評(píng)估研究中指出[17]，當(dāng)腸桿菌屬、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)，報(bào)告是否檢出耐藥基因并預(yù)測(cè)可能的耐藥類(lèi)型，例如CTX-M陽(yáng)性提示腸桿菌屬和或鮑曼不動(dòng)桿菌和或銅綠假單胞菌桿菌對(duì)三代頭孢菌素耐藥。即使有這種情況下，也不排除檢出的耐藥菌與耐藥基因互不相關(guān)，可能來(lái)源于檢測(cè)panel內(nèi)或外的其它病原體。因此，首先耐藥基因報(bào)告需要耐藥菌盡可能的“一對(duì)一”，將常見(jiàn)耐藥菌檢出作為第一要素，再去報(bào)告耐藥基因，其次，閾值設(shè)定對(duì)于TEM等常在陰性對(duì)照或臨床報(bào)告陰性樣本檢出的樣本至關(guān)重要。

③因耐藥基因拷貝數(shù)與對(duì)應(yīng)細(xì)菌含量在某種程度相關(guān)聯(lián)，可以基于mNGS大數(shù)據(jù)建立關(guān)聯(lián)模型將細(xì)菌與耐藥基因進(jìn)行對(duì)應(yīng)。對(duì)于未有較大把握判斷耐藥基因來(lái)源、精準(zhǔn)歸類(lèi)的情況（如銅綠假單胞菌與肺炎克雷伯菌同時(shí)檢出，較難判斷KPC來(lái)源），尤其對(duì)陰性菌相關(guān)的耐藥基因，建議如實(shí)呈現(xiàn)，提示臨床參考培養(yǎng)藥敏結(jié)果做出最終判斷。

一般情況下，尤其對(duì)于開(kāi)放性氣道的樣本，檢出的耐藥基因不能充分確認(rèn)耐藥基因的宿主來(lái)源，例如mecA基因可能源自于呼吸道樣本中存在的凝固酶陰性葡萄球菌，而非檢出的金黃色葡萄球菌。面對(duì)“宏”視角下的病原體多樣檢出，行業(yè)代表企業(yè)在積累數(shù)千例病原體陽(yáng)性樣本的宏基因與宏轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)后，采用spearman或pearson模型分析病原體和耐藥基因序列數(shù)相關(guān)性，綜合高斯分布模型和分離株藥敏結(jié)果得出分析病原體和耐藥基因序列數(shù)閾值，并計(jì)算出病原體和耐藥基因的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)度，以期能夠解決部分非唯一菌種來(lái)源的耐藥基因歸屬問(wèn)題。

④一些試劑盒的測(cè)試結(jié)果表明，尤其對(duì)于革蘭陰性桿菌相關(guān)的耐藥基因（KPC、NDM、VIM、OXA-48），即使在不能精準(zhǔn)歸類(lèi)的情況下，檢出的基因型與后續(xù)分離菌株的表型具有很高的一致性，對(duì)于疾病盡早診治具有提示。而且評(píng)測(cè)顯示mecA基因型或表型的一致性也接近80%[17]。

⑤針對(duì)檢出的、可報(bào)級(jí)別的耐藥基因可以預(yù)測(cè)并報(bào)告對(duì)應(yīng)的耐藥藥物。因定植或感染判斷需要綜合臨床多維度信息，不建議檢測(cè)單位/檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室直接基于耐藥基因進(jìn)行用藥指導(dǎo)。對(duì)于隨著研究深入確認(rèn)有明確意義的耐藥基因，建議定期進(jìn)行文獻(xiàn)回顧并及時(shí)進(jìn)行后續(xù)增補(bǔ)與報(bào)告。同時(shí)建議定期進(jìn)行大數(shù)據(jù)回顧，統(tǒng)計(jì)分析及與臨床專(zhuān)家回顧，對(duì)可能有特殊意義或新的耐藥基因進(jìn)行挖掘。

目前有mNGS檢測(cè)單位在報(bào)告多種耐藥基因的同時(shí)，也會(huì)對(duì)臨床用藥給出建議。如前述提及，環(huán)境、人體皮膚/呼吸道亦可存在耐藥基因，諸多耐藥基因耐藥機(jī)制不明確，并且患者診治個(gè)體化差異較大，病史，感染部位，既往抗菌藥物的使用等因素均會(huì)影響患者用藥選擇，因此不建議檢測(cè)單位尤其第三方檢測(cè)單位在不充分了解患者基本情況等信息時(shí)對(duì)患者用藥給出指導(dǎo)。另外，因mNGS技術(shù)廣覆蓋的特點(diǎn)，建議通過(guò)定期的文獻(xiàn)查詢(xún)或?qū)＜易稍?xún)等方式，對(duì)耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)定期更新或數(shù)據(jù)回顧分析，納入臨床逐步明確的耐藥基因如MCR-1并報(bào)告也具有重要意義。通過(guò)前述的指南文件中對(duì)耐藥基因的闡述，基于目前的臨床狀態(tài)及技術(shù)手段，其中推薦了mNGS可報(bào)告的耐藥基因，見(jiàn)表1。

表1 推薦mNGS可報(bào)告的部分耐藥基因

3 解讀要點(diǎn)

當(dāng)檢測(cè)單位能夠按照如上原則出具規(guī)范化的mNGS耐藥基因報(bào)告，將報(bào)告發(fā)放至臨床后，臨床如何準(zhǔn)確解讀至關(guān)重要。因此，除外規(guī)范化報(bào)告要點(diǎn)外，在臨床解讀中也同樣需要注意以下幾點(diǎn)：

①一般情況下，菌量含量較高的樣本如肺泡灌洗液更容易檢測(cè)到耐藥基因，無(wú)菌體液雖耐藥基因應(yīng)用價(jià)值高，但受限于方法學(xué)檢測(cè)限度較難覆蓋耐藥基因。臨床樣本尤其無(wú)菌體液沒(méi)有檢測(cè)到耐藥基因不表示檢出的細(xì)菌不耐藥。技術(shù)優(yōu)化層面可以通過(guò)去宿主反向富集和或設(shè)計(jì)探針、正向富集的方式捕獲耐藥基因，進(jìn)而提高耐藥基因檢出比例。

質(zhì)?；蛉旧w來(lái)源的耐藥基因是基因組組成的一小部分，理論上無(wú)偏性的mNGS可以在覆蓋到耐藥基因。但受限于人源背景、物種基因組大小與檢測(cè)靈敏度等因素，臨床樣本尤其無(wú)菌體液未檢測(cè)出目標(biāo)耐藥基因不表示檢出的細(xì)菌不耐藥，因此現(xiàn)階段僅作為mNGS的重要附加分析。魯辛辛等發(fā)表的mNGS共識(shí)指出如果需要對(duì)耐藥基因或毒力基因進(jìn)行分析，可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或者結(jié)合耐藥相關(guān)基因或毒力基因進(jìn)行靶向捕獲富集后進(jìn)行[7]。對(duì)于臨床常見(jiàn)重要耐藥菌相關(guān)的耐藥基因，如CTX-M、KPC、NDM、MecA等，可以通過(guò)探針捕獲富集技術(shù)提高檢測(cè)靈敏度，已有捕獲技術(shù)用于腸道耐藥組檢測(cè)，研究指出相比于常規(guī)mNGS，耐藥基因的檢出比例與覆蓋度均顯著提高[18]。

②與其它基于核酸的耐藥基因分子檢測(cè)相同，耐藥基因是否可以真正表現(xiàn)耐藥，即基因型與功能表型是否一致，需要深入的數(shù)據(jù)支持。呼吸道或全血病原菌和耐藥基因多重PCR檢測(cè)技術(shù)可以為mNGS耐藥基因表型判斷提供參考。根據(jù)EUCAST與CLSI標(biāo)準(zhǔn)，更可靠的耐藥結(jié)果以表型實(shí)驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)。即使在判斷耐藥提示準(zhǔn)確的情況下，仍需要已經(jīng)患者病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)等多維度數(shù)據(jù)判讀感染與否。因此，建議臨床在解讀mNGS耐藥基因結(jié)果時(shí)知曉上述情況，并依據(jù)來(lái)自于文獻(xiàn)、流行病學(xué)等多方位信息做出診療決策。

關(guān)于mNGS臨床重要耐藥基因檢出表型與一致性的數(shù)據(jù)，暫未有明確發(fā)表的數(shù)據(jù)，行業(yè)代表企業(yè)的自研數(shù)據(jù)表明，在現(xiàn)有疑難危重特殊感染患者的群體選擇下，常見(jiàn)重要耐藥基因的基因型與表型一致性可以超過(guò)90%，如通過(guò)耐藥基因-耐藥菌關(guān)聯(lián)模型判斷CTX-M來(lái)自于肺炎克雷伯菌的樣本，與同一份臨床培養(yǎng)陽(yáng)性樣本藥敏試驗(yàn)的一致性為96.67%，判斷mecA來(lái)自于金黃色葡萄球菌的樣本，與同一份臨床培養(yǎng)陽(yáng)性樣本藥敏試驗(yàn)的一致性為95.83%(未發(fā)表)。T2 Biosystems開(kāi)發(fā)的針對(duì)全血進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)的產(chǎn)品性能評(píng)估（2021微生物和感染學(xué)會(huì)（ECCMID）摘要內(nèi)容）可以為mNGS重要耐藥基因檢出的表型判斷提供一定的參考。

4 結(jié)語(yǔ)

耐藥基因檢測(cè)作為mNGS的應(yīng)用深化方向之一，未來(lái)在臨床應(yīng)用層面具有較大的想象空間。面對(duì)現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報(bào)告的一些亂像，通過(guò)深入的調(diào)研及專(zhuān)家咨詢(xún)，本研究提出了mNGS耐藥基因報(bào)告與解讀要點(diǎn)，希望對(duì)于行業(yè)規(guī)范化發(fā)展有所裨益。