肖瑞霞，張 珂，修賀明

（河南金泰生物技術(shù)股份有限公司，河南 鄭州 450000）

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因位于第19號(hào)染色體長臂13區(qū)2帶，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，分子量為34KDa，由299個(gè)氨基酸組成[1]。APOE有3種不同的等位基因，編碼3種不同的蛋白質(zhì)亞型E2、E3、E4，并通過氨基酸序列第112和158位第四外顯子中C/T核苷酸的變化進(jìn)行區(qū)分，當(dāng)精氨酸或半胱氨酸發(fā)生變化時(shí)，E2亞型在112和158處存在半胱氨酸殘基；E3亞型在112處存在半胱氨酸，在158處存在精氨酸；E4亞型在2個(gè)位置存在精氨酸[2]。APOE基因可產(chǎn)生6種基因型，E2/E2、E3/E3、E4/E4 3種純合子型和E2/E3、E2/E4、E3/E4 3種雜合子型[3]。APOE基因編碼的載脂蛋白E是多種脂蛋白的一部分，如乳糜蛋白、極低密度蛋白、低密度蛋白和高密度蛋白，在脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)中具有重要意義，是影響血脂水平的重要內(nèi)在因素[4]。載脂蛋白E的合成主要在肝臟中進(jìn)行，也存在于腎臟、腸道、大腦、巨噬細(xì)胞、性腺和脾臟等其他組織中[5]。據(jù)報(bào)道，在神經(jīng)系統(tǒng)，主要是大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌這種載脂蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)元的脂質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)中起著重要作用[6]。針對(duì)不同人群的研究表明，APOE基因多態(tài)性參與血脂水平的變化，是動(dòng)脈粥樣硬化早期及發(fā)展過程中個(gè)體差異的主要原因，也是老年癡呆（AD）、冠心病、腦梗死等疾病的易感候選基因[7-8]。在人群中E3亞型最常見，它的功能和特征與人類的壽命有關(guān)；E2亞型具有保護(hù)作用，不利于乳糜蛋白的代謝，參與低密度脂蛋白的代謝，與Ⅲ型高脂血癥的發(fā)生有關(guān)；E4亞型是血漿膽固醇差異的主要決定因素，也是心腦血管相關(guān)疾病的遺傳危險(xiǎn)因素[9-11]。本研究通過對(duì)河南地區(qū)漢族人群的APOE基因多態(tài)性進(jìn)行分析，最終實(shí)現(xiàn)心腦血管疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，以達(dá)到降低心腦血管疾病的發(fā)病率或延緩發(fā)病的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 柱式口腔拭子基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），無水乙醇（天津市天力化學(xué)），恒溫金屬?。ê贾菝讱W），超微量蛋白核酸濃度分析儀（Biodrop），高速離心機(jī)（上海力申），低溫冰箱（海爾），PCR擴(kuò)增儀（ABI），10 SpectroCHIP? CPM-96 Arrays試劑盒（Agena），純凈水（本實(shí)驗(yàn)室自制），引物由上海生工合成，靜音混合器，DNA質(zhì)譜儀（Agena MassARRA 系統(tǒng)）。

1.2 分析方法

1.2.1 研究對(duì)象 根據(jù)知情同意的原則，采用口腔拭子采集河南地區(qū)漢族受檢人群的口腔黏膜細(xì)胞，抽提DNA進(jìn)行遺傳檢測，共獲取有效樣本量363例，其中男性188例，女性175例。

1.2.2 DNA提取 取100 μL的口腔黏膜細(xì)胞懸液，采用上海生工的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，DNA采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，濃度大于2 ng/μL均可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 根據(jù)NCBI發(fā)表的人的APOE基因標(biāo)準(zhǔn)序列，應(yīng)用AgenaCX在線軟件針對(duì)rs429358和rs7412 2個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。擴(kuò)增體系分3步，PCR反應(yīng)體系：ddH2O 0.8 μL，含有 20 mmol/L MgCl2的 10×PCR Buffer 0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μL，5 U/μL PCR 酶0.2 μL，PCR-F、PCR-R 引物各 0.5 μL，模板 DNA 2 μL；SAP反應(yīng)：ddH2O 1.53 μL，SAP Buffer 0.17 μL，SAP 酶 0.3 μL；iPLEX 延伸反應(yīng)：ddH2O 0.619 μL，iPLEX Buffer 0.2 μL，iPLEX Termination mix 0.2 μL，iPLEX 酶 0.041 μL，EXT-F、EXT-R延伸引物混液0.94 μL，總體積為9 μL。PCR反應(yīng)程序，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，45個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72℃延伸 5 min；SAP反應(yīng)：37 ℃ 40 min，85℃ 5 min，4 ℃ 2 min；iPLEX 反應(yīng)：94 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 5 s，5 個(gè)循環(huán)（52 ℃ 5 s，80 ℃5 s）），2 ℃ 5 min。

表1 APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T PCR和iPLEX引物序列

1.2.4 分析基因型 按照相關(guān)操作流程，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）檢測。將密封保存?zhèn)溆玫腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物通過點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到SpectroCHIP芯片上，進(jìn)行質(zhì)譜檢測。由于分子量不同，同一個(gè)SNP的等位基因形成不同的檢測峰得出各自的基因分型。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用χ2檢驗(yàn)基因型頻率和等位基因頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，當(dāng)P＞0.05時(shí)，認(rèn)為基因型頻率和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，當(dāng)P＜0.05時(shí)，各基因型的實(shí)際值和理論值之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為基因型頻率和等位基因頻率分布不符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結(jié)果

2.1 APOE基因型分型結(jié)果 經(jīng)檢驗(yàn)APOE 2個(gè)SNP位點(diǎn)rs429358和rs7412在河南漢族人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），說明本研究所選擇的樣本具有群體代表性。SNP分型結(jié)果表明，河南漢族人群APOE基因rs429358 T/C位點(diǎn)存在TT、TC、CC基因型，其頻率分別為87.05%、12.40%和0.55%；T和C等位基因頻率分別為93.25%和6.75%。而rs7412 C/T位點(diǎn)存在CC、CT和TT基因型，基因頻率分別為83.20%、14.88%和1.92%；C和T等位基因頻率分別為90.63%和9.37%。DNA分型結(jié)果見圖1。在河南漢族人群中，APOE基因rs429358T/C和rs7412 C/T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在不同性別間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1 河南漢族人群APOE基因rs429358T/C和rs7412 C/T飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)果圖

表2 APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T多態(tài)性在河南漢族不同性別人群中的比較 [ 例(%)]

2.2 APOE基因多態(tài)性分布 APOE基因上的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs429358和rs7412可產(chǎn)生3種不同的基因亞型APOE2、APOE3、APOE4和 6種不同的表型 E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4、E3/E4，每種基因型在河南人群中的分布頻率見表3。APOE不同的基因型與發(fā)生心腦血管疾病、老年癡呆等風(fēng)險(xiǎn)不同，服用他汀類藥物的療效也不同，最終將6種不同的表型分為3大類，APOE保護(hù)基因型（E2/E2，E2/E3），APOE 常見基因型（E3/E3，E2/E4）和APOE危險(xiǎn)基因型（E3/E4，E4/E4），在河南漢族人群中這3種類型占比分別為15.15%，73.55%和11.29%。這3種類型組合在不同性別間的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.850，P＞0.05），本次研究納入的樣本具有群體代表性。

表3 APOE6種基因型在河南漢族人群中的分布頻率 [ 例(%)]

2.3 河南地區(qū)APOE等位基因分型頻數(shù)和頻率與其他地區(qū)比較 地區(qū)APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T多態(tài)性分型頻率的分布情況與潮汕[12]、北京[13]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.151、P=0.010，χ2=10.137、P=0.006）；其分布情況與梅州[14]、武漢[15]、江西[16]、重慶[17]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.241、P=0.120，χ2=5.521、P=0.063，χ2=0.623、P=0.732，χ2=0.091、P=0.955），見表 4。

表4 不同地區(qū)APOE等位基因分型頻數(shù)和頻率比較[ 例(%)]

3 討論

心腦血管疾病是最常見的死亡和致殘?jiān)蛑弧Ｓ捎谖覈丝诶淆g化加劇，高脂血癥的患病率也不斷提高，心腦血管疾病負(fù)擔(dān)預(yù)計(jì)將進(jìn)一步增加。許多研究表明，心腦血管疾病的病因較復(fù)雜，包括遺傳和環(huán)境因素[18]。

載脂蛋白E主要運(yùn)輸脂蛋白，APOE基因的突變可以引起血脂的異常。脂代謝異常是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，研究表明APOE基因與老年癡呆等疾病密切相關(guān)，同時(shí)其具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用[19]。APOE 2個(gè)SNP位點(diǎn)rs429358和rs7412基因的多態(tài)性可以影響機(jī)體的脂代謝、他汀類藥物的療效，是心腦血管疾病的候選基因[20]。他汀類藥物能夠增加肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體的數(shù)量和活性來達(dá)到降脂的目的，正常人群中E3/E3分型最多，他汀類藥物療效較好。APOE4基因型所表達(dá)的E4蛋白與肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體親和力低，明顯增加了心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，他汀類藥物對(duì)這種基因型的患者往往療效不佳或者無效[21]。本研究對(duì)河南地區(qū)漢族人群中APOE基因多態(tài)性的分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在APOE 6種基因型種E3/E3最為常見，分布頻率達(dá)到71.9%，高于文獻(xiàn)報(bào)道中的60%；E2/E4分布頻率為1.65%，略低于文獻(xiàn)報(bào)道的2.00%[25]。E3等位基因被認(rèn)為是世界上大多數(shù)人群中的野生等位基因，參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，在代謝中起著關(guān)鍵作用，在一個(gè)群體中E3等位基因的頻率高，影響血脂狀況的疾病風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)降低[22]。本研究中各種人群E2等位基因的頻率較低，E2/E2為1.93%，高于報(bào)道的1%；E2/E3分布頻率為13.22%，高于報(bào)道的13.00%[25]；E2等位基因?qū)Φ兔芏戎鞍捉档推鸨Ｗo(hù)作用，它編碼的載脂蛋白不易與肝臟受體結(jié)合，影響與代謝性疾病相關(guān)的乳糜微粒的代謝[23]；E4等位基因被認(rèn)為是心腦血管疾病發(fā)生的遺傳危險(xiǎn)因素，可作為高脂血癥和心腦血管疾病預(yù)防計(jì)劃的初步篩選指標(biāo)，在河南漢族人群中E3/E4分布頻率為10.74%，低于報(bào)道的22.00%，E4/E4為0.55%，低于報(bào)道的2.00%[24-25]。從上述研究結(jié)果可以看出，河南地區(qū)漢族人群E4分型低于國內(nèi)其他報(bào)道的水平；與我國其他地區(qū)人群的APOE基因3種分型的頻率比較發(fā)現(xiàn)，河南人群的3種分型的頻率與重慶人群的基因頻率最為接近，與潮汕人群的差異較大，梅州和北京地區(qū)的E4基因型占比較高；對(duì)APOE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，可以明確基因分型，對(duì)攜帶E4基因的患者進(jìn)行用藥指導(dǎo)，干預(yù)飲食、生活習(xí)慣等，最終達(dá)到心腦血管疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療、延緩發(fā)病的目的。

MALDI-TOF是近年發(fā)展起來檢測核酸的強(qiáng)有力工具，它的原理就是利用激光激發(fā)樣本，使樣本與基質(zhì)之間發(fā)生電荷的轉(zhuǎn)移，樣本在電場的作用下，由于分子量不同，產(chǎn)生不同的荷之比，在飛行管道內(nèi)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同，以此鑒別出不同的堿基。由于該技術(shù)具有準(zhǔn)確率高、耗時(shí)短，在基因多態(tài)性的分型中應(yīng)用越來越廣泛，在診斷檢測中具有一定的優(yōu)勢。