王戰(zhàn)輝，張素霞，吳聰明，沈建忠

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

藥物化學(xué)指的是應(yīng)用化學(xué)和生物學(xué)的概念及方法發(fā)現(xiàn)、確證和開發(fā)新藥，從分子水平上研究藥物的作用機(jī)制及其在體內(nèi)的作用方式。藥物化學(xué)的內(nèi)容涉及發(fā)現(xiàn)、修飾和優(yōu)化先導(dǎo)化合物，從分子水平上揭示藥物及具有生理活性物質(zhì)的作用機(jī)理，研究藥物及生理活性物質(zhì)在體內(nèi)的代謝過程。近代藥物化學(xué)的發(fā)展非常迅速。藥物化學(xué)家們一直在研究如何能夠通過合理藥物設(shè)計(jì)而發(fā)現(xiàn)新藥，在計(jì)算機(jī)科學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科高速發(fā)展的今天，特別是計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)(computer aided drug design，CADD)的完善，利用計(jì)算機(jī)模擬、高效合成技術(shù)可以加快新藥發(fā)現(xiàn)的速度，降低新藥開發(fā)的成本[1]。CADD已經(jīng)成為當(dāng)前藥物合理設(shè)計(jì)中不可或缺的環(huán)節(jié)。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，藥物作用的靶點(diǎn)中最多的是受體，其次是酶，另外還有離子通道和核酸，但占比較少。盡管藥物作用靶點(diǎn)可能不同，但是藥物的作用方式都是以非鍵相互作用為主，比如疏水作用力、氫鍵、范德華力等[2]。相對于比較直觀的原子與原子之間的共價(jià)鍵、離子鍵等，非鍵相互作用要更加抽象。目前，主流的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析方法有X射線晶體衍射法、核磁共振法和冷凍電鏡法3種。X射線晶體衍射法的前提是獲得蛋白質(zhì)晶體，然后通過X射線衍射解析蛋白的三級結(jié)構(gòu)，這種方法分辨率較高，一般能做到0.3 nm以內(nèi)。核磁共振法要求蛋白分子量要小且穩(wěn)定，適用范圍要小于X射線衍射法。近些年發(fā)展比較迅速的冷凍電鏡法有其得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，適合用于解析病毒、細(xì)胞等生物結(jié)構(gòu)中較大的蛋白質(zhì)，但也有分辨率不高，不適合解析較小蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)。目前，通過冷凍電鏡解析的最小蛋白質(zhì)為52 ku，分辨率僅有0.32 nm[3]?？傮w而言，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)解析的速度較慢，成本較高，很多時(shí)候不能滿足科研的需要。因此，基于蛋白的一級結(jié)構(gòu)建立其三維結(jié)構(gòu)模型就成為一種非常重要的計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)。

隨著蛋白質(zhì)建模技術(shù)的發(fā)展，建模方法逐漸歸為兩種，分別是從頭設(shè)計(jì)和同源建模。從頭設(shè)計(jì)依賴強(qiáng)大的計(jì)算資源和復(fù)雜的算法，應(yīng)用沒有同源建模廣泛。同源建模是在有相似蛋白質(zhì)模板的情況下構(gòu)建目標(biāo)序列的三維結(jié)構(gòu)模型的方法，而且是目前使用最廣泛、預(yù)測最可靠的建模方法[4]。通過建立蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，對于深入研究藥物與靶點(diǎn)之間的非鍵相互作用具有重要的意義，為藥物的合理設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。獲得蛋白質(zhì)的模型后，就可以對其進(jìn)行分子對接，分析受體-配體之間的相互作用。分子對接的產(chǎn)生可以追溯到19世紀(jì)Fisher提出的受體學(xué)說，最經(jīng)典的模型就是鎖鑰模型[5]。隨著受體學(xué)說的發(fā)展，人們對藥物分子與靶點(diǎn)的相互作用有了更深入的認(rèn)識。目前，基于藥物分子與靶點(diǎn)之間的空間匹配和能量匹配的分子對接方法主要分為剛性對接、半柔性對接和柔性對接3類[6]。剛性對接計(jì)算量相對較小，參與對接的藥物分子和受體的構(gòu)象均不發(fā)生變化，計(jì)算速度較快，但是計(jì)算精度較差，一般用于大分子對接或大量對接初步篩選等。柔性對接需要的計(jì)算量較大，該方法需要同時(shí)把藥物分子和受體構(gòu)象的變化考慮進(jìn)去，因此，適合精確的分子對接。半柔性對接需要的計(jì)算量適中，一般固定受體的構(gòu)象，然后考慮藥物分子的結(jié)構(gòu)變化，該方法的計(jì)算結(jié)果相對準(zhǔn)確，需要的計(jì)算資源又不是特別巨大，是應(yīng)用最廣泛的對接方法之一。常用的分子對接軟件有Discovery Studio、Sybyl、MOE、Rosetta、Schrodinger、AutoDock等[7]。

在本文中，選擇Discovery Studio軟件中的同源建模模塊構(gòu)建磺胺類藥物受體蛋白DHPS的三維結(jié)構(gòu)模型，然后使用半柔性對接方法CDOCKER進(jìn)行受體-配體的分子對接，通過二維平面圖以及三維結(jié)構(gòu)圖展示藥物分子與受體之間的相互作用方式，借助直觀的模擬展示，以提升學(xué)習(xí)藥物化學(xué)的效果。

1 研究方法和原理

1.1 Discovery Studio簡介

Discovery Studio(DS)是基于Windows/Linux系統(tǒng)的分子建模和模擬軟件，在藥物發(fā)現(xiàn)、藥物結(jié)構(gòu)功能研究等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。DS軟件界面友好，功能完善，易于學(xué)習(xí)，是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)最常用的模擬軟件之一[8]。DS涵蓋疾病的發(fā)病機(jī)理研究、新藥發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)、計(jì)算藥物化學(xué)、生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤藥物研究等研究領(lǐng)域。功能模塊包括基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)模塊、基于片段的藥物設(shè)計(jì)模塊、基于藥效團(tuán)的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)模塊、基于小分子的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)模塊、蛋白質(zhì)建模及模擬模塊、分子力學(xué)、分子動力學(xué)和量子力學(xué)模擬模塊等。利用DS軟件學(xué)習(xí)藥物化學(xué)，可直觀地觀察配體與受體間的結(jié)合位點(diǎn)，并將兩者間的非鍵相互作用以圖形的方式展示，可對分子間相互作用有感性認(rèn)識，加深對受體-藥物相互作用的理解。DS有單機(jī)版本和免費(fèi)的Discovery Studio Visualizer模塊，可隨時(shí)利用個(gè)人電腦自主練習(xí)，加深學(xué)習(xí)印象，激發(fā)對抽象概念的興趣。

1.2 蛋白質(zhì)同源建模

磺胺類藥物受體蛋白二氫蝶酸合成酶(DHPS)是研究磺胺類藥物關(guān)于細(xì)菌耐藥產(chǎn)生的影響[9]和基于此受體的新型抗菌藥物的關(guān)鍵蛋白?？蒲泄ぷ髡邆儨y定了多種來源的DHPS基因序列，并通過蛋白結(jié)晶和分子模擬技術(shù)等獲得了受體的三維結(jié)構(gòu)，目前，Protein Data Bank中已經(jīng)收錄了包括6種細(xì)菌來源、1種真菌來源的DHPS晶體結(jié)構(gòu)。

DHPS的氨基酸序列可以通過文獻(xiàn)或者NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。以蛋白3tyz為例，通過NCBI下載FASTA格式的氨基酸序列文件并用DS軟件打開，展開Macromolecules下的Create Homology Models模塊，點(diǎn)擊BLAST Search進(jìn)行模板搜索，選擇氨基酸序列一致性75%的lajoA作為模板蛋白，通常認(rèn)為一致性大于60%則模板蛋白質(zhì)量較好。點(diǎn)擊Load Structure and Aligment進(jìn)行模板蛋白的下載和序列比對(如圖1所示)。點(diǎn)擊Create Homology Models模塊下的Build Homology Models，以lajoA作為模板蛋白構(gòu)建蛋白三維模型(如圖2所示)并采用拉氏構(gòu)象圖和Profile-3D對其進(jìn)行評估。拉氏構(gòu)象圖通過選取主菜單Chart下的Ramachandran Plot顯示，Profile-3D通過點(diǎn)擊Create Homology Models模塊下的Verify Protein(Profile-3D)進(jìn)行計(jì)算。

圖1 模板1ajoA與3tyz的序列比對結(jié)果

1.3 受體-配體分子對接

多種來源的DHPS已經(jīng)被解析出了晶體結(jié)構(gòu)[10]，研究發(fā)現(xiàn)，其結(jié)合位點(diǎn)相對固定，極大方便了對接活性位點(diǎn)的選擇。如果結(jié)合位點(diǎn)不能確定，則需要進(jìn)行氨基酸突變來試驗(yàn)確認(rèn)。

1.3.1 配體分子的構(gòu)建 以磺胺甲噁唑SMZ作為分子對接的配體分子。使用ChemDraw軟件繪制SMZ結(jié)構(gòu)并導(dǎo)入到DS軟件中，展開Small Molecules下的Minimize Ligands模塊，點(diǎn)擊Full Minimization進(jìn)行小分子結(jié)構(gòu)批量優(yōu)化。配體分子的獲得途徑有很多種，對于常見的配體分子可以直接從公開的Pubchem數(shù)據(jù)庫中獲得其結(jié)構(gòu)，對于不常見的配體分子則可以通過ChemOffice或DS軟件直接繪制，再通過DS進(jìn)行簡單優(yōu)化即可，當(dāng)然也可以通過高斯軟件對其進(jìn)行量子力學(xué)優(yōu)化[11]，獲得其最低能量構(gòu)象。

圖2 蛋白3tyz模型(a)、拉氏構(gòu)象圖(b)及其Profile-3D圖(c)

1.3.2 定義結(jié)合位點(diǎn)以及分子對接 要進(jìn)行分子對接，首先要定義結(jié)合位點(diǎn)。展開DS軟件中Receptor-Ligand Interactions下的Define and Edit Binding Site模塊，點(diǎn)擊From Receptor Cavities，可獲得多個(gè)活性位點(diǎn)，由于磺胺類藥物受體蛋白DHPS的活性口袋相對固定，選擇與以往研究和實(shí)驗(yàn)相符的口袋作為分子對接結(jié)合位點(diǎn)。確定結(jié)合位點(diǎn)之后進(jìn)行分子對接，展開Receptor-Ligand Interactions下的Dock Ligands模塊，點(diǎn)擊Dock Ligands(CDOCKER)，選好受體、配體和活性位點(diǎn)點(diǎn)擊確定進(jìn)行對接計(jì)算。對接完成后，展開Receptor-Ligand Interactions下的View Interactions，點(diǎn)擊Ligand Interactions，即可展示受體-配體相互作用關(guān)系。點(diǎn)擊Show 2D Diagram，就可以看到平面的受體-配體互作圖(如圖4所示)，點(diǎn)擊Hydrophobic，可以展示受體疏水作用表面(如圖5a所示)；點(diǎn)擊H-bond，可以展示受體氫鍵表面(如圖5b所示)。

圖3 3tyz蛋白模型與配體分子的對接構(gòu)象圖(a)和3tyz蛋白晶體復(fù)合物圖(b)

圖4 受體-配體相互作用平面圖

圖5 受體疏水作用力表面圖(a)和氫鍵作用力表面圖(b)

2 結(jié)果

2.1 DHPS序列比對、同源建模與評估

3tyz氨基酸序列與模板蛋白lajoA的氨基酸序列進(jìn)行比對(如圖1所示)，一致性較好，達(dá)到75%，深藍(lán)色表示氨基酸完全一致，代表一致性，淺藍(lán)色表示氨基酸不一樣但性質(zhì)相近，代表相似性，序列比對結(jié)果比較理想，滿足一致性大于60%的條件，因此選擇lajoA為模板蛋白。以lajoA為模板進(jìn)行同源建模后，可以看到建模后的3tyz三維結(jié)構(gòu)(如圖2a所示)。拉氏構(gòu)象圖中藍(lán)線內(nèi)為“最適區(qū)”，該區(qū)域的氨基酸數(shù)量越多，結(jié)構(gòu)越可信，紫色線內(nèi)為“允許區(qū)”，表示結(jié)構(gòu)可接受，紅色點(diǎn)表示構(gòu)象不合理的氨基酸需要優(yōu)化。評估結(jié)果顯示，氨基酸處于合理區(qū)間的比例大于95%，符合要求。圖2c為Profile-3D評估法中每個(gè)氨基酸的打分情況，氨基酸打分低于0的只有2個(gè)，大部分氨基酸打分較高，說明模型質(zhì)量較好。通過評估，建立的3tyz模型符合要求。3tyz蛋白模型對接后與3tyz蛋白復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，模型與結(jié)晶結(jié)構(gòu)相似性非常高(圖3a，3b)。以存在晶體結(jié)構(gòu)的3tyz進(jìn)行同源建模的目的是為了模型能夠與晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，沒有實(shí)際的應(yīng)用意義，通常有了晶體結(jié)構(gòu)就不需要再進(jìn)行蛋白建模。建模模型與晶體結(jié)構(gòu)相比較可以更加直觀的展示同源建模技術(shù)。

2.2 受體-配體分子對接及相互作用關(guān)系

蛋白模型與配體SMZ能夠很好地進(jìn)行對接，對接結(jié)果顯示，氨基酸THR(73)、ARG(74)和ARG(266)與SMZ發(fā)生氫鍵相互作用，用綠色表示；氨基酸LYS(232)與SMZ發(fā)生弱氫鍵相互作用，用淺綠色表示；氨基酸PHE(201)、PRO(75)、ARG(74)、LYS(232)與配體存在范德華力，較強(qiáng)的力用紫色表示，較弱的力用淺紫色表示(圖4所示)。最優(yōu)分子對接結(jié)果表明，受體3tyz與配體SMZ主要通過疏水作用力(圖5a)、氫鍵(圖5b)等作用力結(jié)合在一起。受體-配體間的范德華力一般較弱，起次要作用。這與通常認(rèn)為的受體-配體相互作用規(guī)律一致，一般情況下，疏水作用力的影響最大，氫鍵次之[12]。

3 展望

在學(xué)習(xí)藥物化學(xué)時(shí)正確、有效地使用DS軟件，開展同源建模和分子對接研究，可讓原本難以理解的受體-藥物分子互作的微觀過程以圖形或動態(tài)方式呈現(xiàn)，使枯燥乏味的學(xué)習(xí)活動變得生動形象、易于接受，可大幅提高學(xué)習(xí)效率，為我國獸藥研發(fā)領(lǐng)域培養(yǎng)合格的藥學(xué)人才提供可靠而有力的技術(shù)支撐。