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        苦參堿與氧化苦參堿的常壓與減壓提取工藝對(duì)比研究

        2022-05-16 02:48:42張冰玉李金金
        關(guān)鍵詞:總堿苦參堿常壓

        韓 飛,張冰玉,李 賢,李金金

        (1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌 712100)

        苦參類生物堿廣泛存在于苦參、苦豆子及廣豆根等豆科植物中[1-2]。這類生物堿表現(xiàn)出廣泛而優(yōu)良的生物活性如抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、鎮(zhèn)痛等[6]。此外,還對(duì)心、肝、肺、腎、腦、血管等具有一定的保護(hù)作用。因此上述富含苦參堿的植物多為我國(guó)長(zhǎng)期使用的中藥資源。

        近年來(lái),隨著對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量限制的加壓以及對(duì)抗生素使用的管控加強(qiáng),人們對(duì)于新型、高效環(huán)保的農(nóng)藥的需求日益增加[7]。中藥以其廣泛的生物活性和相對(duì)較低的毒性,逐漸引起人們的重視。近些年出現(xiàn)了很多關(guān)于中藥活性成分作為農(nóng)藥的研究[8-9]??鄥A對(duì)植物和動(dòng)物害蟲均表現(xiàn)出顯著的毒殺作用[10-11],還能抑制多種影響作物生長(zhǎng)的真菌或細(xì)菌[12-13]。此外,苦參類生物堿也顯現(xiàn)出植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性[14-15]。因此,含有苦參的中藥具有直接開發(fā)為農(nóng)藥或獸藥的價(jià)值。

        在苦參類生物堿中,具有顯著藥理活性的分子是苦參堿和氧化苦參堿。這兩種物質(zhì)的作用與功效大致相同。但是,相比氧化苦參堿,苦參堿具有毒性,使得苦參直接作為藥物使用會(huì)存在一定的安全隱患,從而限制苦參類藥物的推廣應(yīng)用??鄥A和氧化苦參堿存在著可以相互轉(zhuǎn)化的化學(xué)反應(yīng)[16],因此通過(guò)適當(dāng)控制條件,使高毒性的苦參堿轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿偷难趸鄥A。

        綜上所述,本研究以中藥苦參飲片作為原材料,在常壓和減壓兩種方式下,通過(guò)改變提取條件來(lái)對(duì)比兩種不同方法的提取效果,以期發(fā)現(xiàn)合適的提取工藝,使得苦參堿與氧化苦參堿的提取率高,而且使其保持一定的比例,降低毒性,從而提高苦參類藥物的臨床使用價(jià)值。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 提取材料 苦參飲片(來(lái)自豆科植物苦參的干燥根[17],批號(hào):20210101),寶雞向源中藥飲片有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

        1.1.2 主要試劑 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)MUST-13021904),氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)MUST-13021902),成都曼斯特生物有限公司產(chǎn)品;無(wú)水乙醇、乙腈均為色譜純,氯仿、磷酸均為分析純,購(gòu)自楊凌天成化玻儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)用純水由實(shí)驗(yàn)室自制[18]。

        1.1.3 主要儀器 高效液相色譜儀(LC-10AT),日本島津公司產(chǎn)品;pH計(jì)(pHS-3C),上海日島科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;1/10萬(wàn)電子分析天平(AE24),瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱量0.528 mg的苦參堿和1.523 mg的氧化苦參堿,分別轉(zhuǎn)移入10 mL棕色容量瓶中,并加入乙腈-無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解稀釋、定容、搖勻,配制成苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液。

        1.2.2 供試品溶液的配制 精確量取10 mL提取液并轉(zhuǎn)移入錐形瓶中,加入適量氨水調(diào)節(jié)其pH 9~10。用6×20 mL的氯仿對(duì)上述溶液進(jìn)行萃取。合并氯仿相,減壓蒸除溶劑,殘余物加入適量無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解,并轉(zhuǎn)移入 25 mL容量瓶中定容、搖勻,得到供試品溶液。

        1.2.3 色譜條件 采用高效液相色譜法測(cè)定提取液中苦參堿和氧化苦參堿的含量。色譜柱:Kromasil NH2柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸80∶10∶10;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流動(dòng)速度:1 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        2 結(jié)果

        2.1 色譜方法性試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 苦參堿與氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品譜圖 圖1和圖2是苦參堿與氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。從圖中可以看出,苦參堿和氧化苦參堿的的保留時(shí)間分別為5.875 min和8.848 min。因此,在一定的色譜條件下,確定了苦參堿和氧化苦參堿的在液相色譜儀上的出峰位置,從而能夠進(jìn)一步對(duì)提取的苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)行定性或定量分析。

        5.875:苦參堿的保留時(shí)間5.875:Retention time of matrine

        8.848:氧化苦參堿的保留時(shí)間8.848:Retention time of and Oxymatrine

        2.1.2 線性關(guān)系 準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液,并分別倒入容量為2 L、4 L、6 L、8 L、16 L、20 L的量杯中,隨后按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量,縱坐標(biāo)為峰面積,建立了兩個(gè)對(duì)照品的回歸方程,分別為y=6.976 105x-3 028.1(R2=0.999 8),y=7.353 105x-7 315.3(R2=0.999 8),線性范圍分別為0.105 6 μg~1.056 μg與0.304 6 μg~3.046 μg之間。

        2.1.3 精密度試驗(yàn) 選用對(duì)照品溶液,繼續(xù)在色譜條件下進(jìn)行6次連續(xù)測(cè)定,得出兩種對(duì)照品溶液的計(jì)算峰值面積分別為1.1%和2.6%,說(shuō)明測(cè)量?jī)x器精密度非常優(yōu)良。

        2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇同樣等量的供試品分別記錄不同時(shí)間段的測(cè)量結(jié)果,記錄的時(shí)間為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h,然后計(jì)算在這些時(shí)間下苦參堿和氧化苦參堿的峰面積分別為2.1%和2.4%,得出最佳的時(shí)間為12 h。

        2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 量取6份同一提取條件的提取液,參照2.1.2的方法制備供試品提取液,按2.1.3的條件進(jìn)行測(cè)定。最終測(cè)得供試品溶液中的苦參堿與氧化苦參堿的峰值面積分別為2.5%和2.7%,表明這種試驗(yàn)方式的重復(fù)性良好。

        2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 量取6份5.0 mL的已知含量的提取液,并依次加入11.76 mL的苦參堿和9.06 mL的氧化苦參堿,繼續(xù)按2.1.2的制備方式制備供試品溶液,并在色譜條件下計(jì)算出苦參堿平均回收率為97.63%、面積為2.2%,氧化苦參堿的平均回收率為98.12%、面積為2.4%,說(shuō)明這種方法具有科學(xué)性。

        2.2 常壓提取工藝的分析與優(yōu)化

        稱取34份10 g苦參飲片,在常壓和減壓條件下,設(shè)置不同的時(shí)間、溫度、次數(shù)、溶劑用量對(duì)其進(jìn)行提取,并結(jié)合液相色譜對(duì)不同提取液中苦參堿與氧化苦參堿的含量進(jìn)行分析,以考察上述因素對(duì)提取效果的影響。提取效果的指標(biāo)通過(guò)提取液中苦參總堿含量(苦參堿與氧化苦參堿的總量),各自的含量以及綜合評(píng)分來(lái)體現(xiàn),權(quán)重系數(shù)為0.5。根據(jù)前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),最佳提取溶劑為水。

        2.2.1 單因素考察

        (1)提取時(shí)間:將提取溫度設(shè)置成恒溫60℃,水料比10∶1,共提取兩次,然后將提取時(shí)間分別設(shè)置成0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。試驗(yàn)結(jié)果如下:苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.81% (0.5 h)、0.99% (1 h)、1.09% (1.5 h)、1.06% (2 h);苦參堿與氧化苦參堿各自的含量分別為0.72%和0.09%(0.5 h)、0.9%和0.09% (1 h)、0.97%和0.12%(1.5 h)、0.93%和0.13%(2 h)。綜合上述兩組數(shù)據(jù),得出各個(gè)溫度下的綜合評(píng)分為0.76 (0.5 h)、0.95 (1 h)、0.92 (1.5 h)、0.84 (2 h)。因此最終確定最佳提取時(shí)間為1 h。

        (2)提取溫度:將提取時(shí)間固定為1 h,水料比與提取次數(shù)不變。然后將提取溫度分別設(shè)置成50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃進(jìn)行提取試驗(yàn)與含量的測(cè)定。得出的結(jié)果分別為:50℃時(shí)苦參總堿含量0.89%,各自含量為0.79%和0.1%,綜合評(píng)分0.89;60℃時(shí)苦參堿與氧化苦參堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.99%,各自含量為0.88%和0.11%,綜合評(píng)分為0.94;70℃時(shí)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.04%、苦參堿和氧化苦參堿含量分別為0.93%和0.11%,綜合評(píng)分為1.00;80℃的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.91%,各自含量為0.78%和0.13%,綜合評(píng)分為0.79;90℃苦參總堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.87%,各自含量為0.73%和0.14%,綜合評(píng)分0.73;100℃總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74%,苦參堿與氧化苦參堿的含量為0.52%和0.22%,綜合評(píng)分為0.5。綜合比較,發(fā)現(xiàn)70℃比60℃的評(píng)分略高,但是綜合實(shí)際工藝成本考慮,選擇60℃作為最佳提取溫度。

        (3)提取次數(shù):將提取溫度、提取時(shí)間、料液比分別固定為60℃、1 h、10∶1,以考察提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示,提取1次的總堿含量、苦參堿與氧化苦參堿的含量分別為0.74%、0.68%和0.06%,綜合評(píng)分為0.85;提取2次的總堿含量、苦參堿和氧化苦參堿各自含量分別為1.01%、0.92%和0.09%,綜合評(píng)分為0.93;提取3次的含量分別為1.05%、0.95%和0.1%,綜合評(píng)分為0.87。以上結(jié)果表明,提取2次和3次效果差別不大。綜合實(shí)際工藝成本考慮,發(fā)現(xiàn)提取2次為最佳條件。

        (4)水料比:本試驗(yàn)所用提取溶劑為水,因此通過(guò)水與提取的苦參飲片原材料用量的比值體現(xiàn)溶劑的使用量。結(jié)果表明,當(dāng)提取溫度均為60℃、提取時(shí)間均為1 h、提取次數(shù)都是2次時(shí),水料比為 8∶1的提取處理中,苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.97%,各自的含量分別為0.08%和0.89%,綜合評(píng)分為0.97;水料比為10∶1處理的苦參總堿含量為1.03%、苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.95%和0.08%,綜合評(píng)分為0.99;12∶1 的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.04%,各自的含量為0.93%和0.1%,綜合評(píng)分為0.87;14∶1的苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.03%、各自含量為0.92%和0.11%,綜合評(píng)分為0.87。綜合各評(píng)分,以及實(shí)際工藝的可行性和合理性,發(fā)現(xiàn)水料比8∶1時(shí)就能達(dá)到最佳的提取效果。

        2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化 經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)最佳提取溫度為60℃。將提取時(shí)間、次數(shù)、水料比作為考察因素,對(duì)提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。提取效果的指標(biāo)為苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、比值以及綜合評(píng)分。

        稱取18份10 g苦參飲片進(jìn)行試驗(yàn),得出結(jié)果如表1,方差分析見表2。從試驗(yàn)表格中可以發(fā)現(xiàn)最能影響常壓工藝提取效果的是提取次數(shù),其次為提取時(shí)間,最后為溶劑用量。最佳組合方案為A1B1C3,但C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響,其他因素不明顯,因此,綜合實(shí)際生產(chǎn)情況A2B1C3更符合現(xiàn)實(shí),為常壓提取工藝的最佳方案,即加8倍水提取3次,每次1 h,分別將3份約為10 g的苦參飲片進(jìn)行驗(yàn)證,得出的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.19%、1.17%、1.20%,苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.84%和0.35%、0.81%和0.36%、0.84%和0.36%。

        表1 苦參常壓提取工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

        表2 常壓提取工藝綜合評(píng)分方差分析

        2.2 減壓提取工藝的分析與優(yōu)化

        取18份10 g的苦參飲片,按照上述同樣的步驟進(jìn)行單因素和正交提取試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析見表4。

        表3 苦參減壓提取工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

        從表中結(jié)果可以看出,影響因素排序與常壓工藝一樣,最佳組合也是A1B1C3,實(shí)際生產(chǎn)工藝最佳組合也是A2B1C3,即加8倍水于70℃減壓提取3次,每次1 h。分別將3份約為10 g的苦參飲片按照以上工藝進(jìn)行驗(yàn)證,得出的苦參堿與氧化苦參堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.16%、1.20%、1.17%,苦參堿和氧化苦參堿的含量依次為0.09%和1.07%、0.08%和1.12%、0.09%和1.08%。

        表4 減壓提取工藝綜合評(píng)分方差分析

        3 討論

        經(jīng)過(guò)對(duì)比后發(fā)現(xiàn),常壓法和減壓法所得苦參堿的含量相近。這說(shuō)明,常壓法和減壓法的提取能力是相同的。但是相比常壓法,減壓提取能夠顯著降低苦參堿的含量。張喻娟等[19]對(duì)苦豆子進(jìn)行了常壓與動(dòng)態(tài)減壓提取,也發(fā)現(xiàn)在減壓條件下氧化苦參堿的含量明顯高于苦參堿,并且認(rèn)為減壓-溫度是提高氧化苦參堿含量的關(guān)鍵條件,即在減壓存在下,高溫限制了氧化苦參堿向苦參堿的轉(zhuǎn)化。但是根據(jù)本研究的結(jié)果分析,也存在另一種可能,即減壓和高溫也會(huì)協(xié)同促進(jìn)苦參堿向氧化苦參堿的轉(zhuǎn)化。這也正是減壓法苦參堿與氧化苦參堿的比值顯著低于常壓法的原因,以及確定減壓提取工藝溫度為70℃的必要性??傊瑴p壓條件是提取工藝中控制活性成分的有效手段,值得圍繞減壓工藝進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化,使其能夠真正為獲得目標(biāo)藥用成分提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

        苦參堿的提取工藝經(jīng)歷了水煎法[20]、乙醇提取法[21]、氯仿提取法[22]、酸水提取法[23]的演變。但是已有的研究表明,以上幾種方法的提取能力和提取效果差別并不大[24]。綜合考慮工藝的成本、可操作性、安全性以及提取效果等因素,最終選取水作為提取溶劑。此外,通過(guò)改變其他條件如提取溫度、料液比、提取時(shí)間等,收到了較好的苦參類生物堿的提取效果,其含量達(dá)到甚至超過(guò)了已有的提取方法[25-26]。

        4 結(jié)論

        以水作為溶劑,通過(guò)對(duì)比試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)減壓提取工藝能夠顯著提高弱毒性成分氧化苦參堿的含量。最佳提取工藝為:水料比8∶1,提取次數(shù)為3次,每次提取時(shí)間1 h,提取溫度70℃。最佳苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及各自的含量為1.20%、0.08%和1.12%。以上提取工藝安全簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、成本低,適合工業(yè)化生產(chǎn),并且能夠有效降低苦參類藥物的毒性成分,增強(qiáng)其推廣應(yīng)用價(jià)值。

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