要慧中，鄒 敏，楊冰可，周璐露，全鉞涵，余傳奇，林 青,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)，甘肅蘭州 730046；3.商南縣畜牧獸醫(yī)中心，陜西商南 726300)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)是反芻動物胃腸道寄生蟲中致病能力極強(qiáng)的一種，主要寄生于山羊、綿羊等家養(yǎng)和野生反芻動物的皺胃和小腸[1]，在世界各國家地區(qū)分布廣泛且感染率高[2]。山羊、綿羊等反芻動物感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲后可出現(xiàn)消瘦、貧血、下腭水腫、生理機(jī)能紊亂等慢性消耗性癥狀，甚至引起幼年動物急性死亡[3-5]，給世界范圍內(nèi)的山羊、綿羊等反芻動物養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)是一段位于18S和28S之間具有種特異性和種內(nèi)高度保守性的核糖體DNA序列[6-7]，近年來已用于多種線蟲的種類鑒定和遺傳進(jìn)化研究[8-10]?；诖?，本研究采用PCR技術(shù)對陜西省咸陽地區(qū)山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、測序與分析，以了解和掌握其ITS基因的分子特征與遺傳變異情況，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的深入研究及其捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體樣品 蟲體分別于2015年、2017年、2019年和2020年采集自陜西省咸陽地區(qū)山羊的皺胃內(nèi)，共采集到樣本蟲體44條，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定全部為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。蟲體用750 mL/L酒精固定，置于-20℃保存。蟲體樣品具體信息如下表1所示。

表1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲來源信息表

1.1.2 主要試劑TaqDNA Polymerase(CW0680)，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒(DP304-02)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；TaKaRa ExTaq?(RR001A)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000(3427A)、瓊脂糖等試劑，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 高速離心機(jī)(HC-2514)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀(TC-XP)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(ChampGel5000)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取 分別選取單個捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次～4次，置于無菌的2 mL Eppendorf管中，再加入200 μL的GA緩沖液用無菌的玻璃棒將蟲體搗碎至均一糊狀。加入20 μL的蛋白酶K，混勻，置于56℃的水浴鍋內(nèi)消化1 h～2 h，每隔30 min反復(fù)顛倒3次～4次。蟲體消化完成后按照中國北京天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒說明書提取蟲體的基因組DNA。

1.2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS基因PCR擴(kuò)增 參考Zhu X等[11]根據(jù)線蟲核糖體DNA保守區(qū)設(shè)計的線蟲通用引物(引物具體信息見表2，引物由北京擎科生物科技有限公司合成)并建立的方法，以蟲體基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的ITS目的基因片段，該基因片段包括28S rDNA的5′端、18S rDNA的3′端以及完整的ITS-1、5.8S、ITS-2基因片段。反應(yīng)體系(25 μL)：雙蒸水17.375 μL，TaKaRaTaq酶 0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，上游引物(NC5) 1.0 μL，下游引物(NC2) 1.0 μL，DNA模板 1.0 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，35個熱循環(huán)；72℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 線蟲通用引物

1.2.3 ITS序列測定與比對 將上述擴(kuò)增出的陽性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。用Chromas 2生物學(xué)軟件對測序結(jié)果中錯讀的堿基位點進(jìn)行矯正，最后使用ClustalX1.83生物學(xué)軟件，將各序列18 S、28 S基因片段剔除，獲得各蟲體樣本ITS-1、5.8S、ITS-2基因片段。

1.2.4 序列分析 使用NCBI網(wǎng)站內(nèi)的Blast對校正后的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、ITS-2序列進(jìn)行同源性檢索。利用生物學(xué)軟件DNAStar7.1內(nèi)的Editseq工具計算捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、ITS-2序列中各堿基含量及A+T、G+C含量，使用MEGA-X軟件進(jìn)行ITS-1、ITS-2序列堿基突變位點的記錄，使用MegAlign軟件對樣ITS-1、5.8 S、ITS-2序列進(jìn)行兩兩之間變異率的計算，分析2015年、2017年、2019年和2020年陜西咸陽地區(qū)羊源捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、5.8 S、ITS-2基因序列的遺傳變異情況。

1.2.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 從GenBank中分別選取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、ITS-2 rDNA基因參考序列。ITS-1參考序列包括：陜西(KX534100)、內(nèi)蒙古(HQ844231)、英國(LS997563)、愛爾蘭(JF680983)、美國(EU086389、AF044929)、新西蘭(KC998765)、老撾(AB908961)、緬甸(MT568604)、伊朗(HQ389229)、肯尼亞(KP760874)、埃及(AB682684)以及外群艾氏毛圓線蟲(Trichostrongylusaxei)ITS-1 rDNA序列(Y15875)；ITS-2參考序列包括：陜西(KX534100)、廣東(KM586652)、美國(EU086376)、老撾(MT682966)、老撾(AB908963)、肯尼亞(KP760873)、奧地利(KU891895)、愛爾蘭(JF680983)、尼日利亞(LC368048)、加納(MH481579)、喀麥隆(MN708989)、澳大利亞(KF364629)以及外群似血矛線蟲(Haemonchussimilis)ITS-2 rDNA序列(MN709008)。將以上參考序列與本研究的樣本(挑選具有代表性的6株蟲體樣本)，采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)分別構(gòu)建ITS-1和ITS-2基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，以探究陜西咸陽地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因進(jìn)化情況以及與其他地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株的進(jìn)化關(guān)系。ML法使用MEGA-X生物學(xué)分子軟件進(jìn)行，設(shè)置Bootstrap method，復(fù)制數(shù)為1000，Tamura 3-parameter模型。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

44條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DNA樣品均成功擴(kuò)增出850 bp左右的目的基因條帶，與預(yù)期大小相符，部分樣品檢測結(jié)果如圖1。

2.2 測序結(jié)果與分析

測序結(jié)果顯示，44株山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1序列長度為400 bp～404 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫中ITS-1參考序列(登錄號為LS997563)相似性為97.01%～99.75%；ITS-2長度為231 bp，與GenBank中ITS-2參考序列(登錄號為LC368048)相似性為96.97%～100%。5.8 S rDNA基因序列經(jīng)比對分析后未發(fā)現(xiàn)堿基差異。使用Editseq軟件測得樣本ITS-1序列中A含量為28.47%～29.46%，T含量為30.69%～32.01%，G含量為19.55%～21.04%，C含量為19.06%～20.54%；A+T含量為59.4%～60.89%，G+C含量為39.10%～40.59%；ITS-2序列內(nèi)A含量為28.95%～32.9%，T含量為34.2%～36.36%，G含量為16.88%～18.42%，C含量為15.58%～16.67%、A+T含量為63.15%～69.26%，G+C含量為32.46～35.09%。ITS-1、ITS-2中A+T堿基含量都明顯高于G+C堿基含量。

使用MEGA-X軟件將蟲體樣本的ITS-1、ITS-2序列分別同GenBank中ITS-1參考序列(登錄號為LS997563)、ITS-2參考序列(登錄號為LC368048)進(jìn)行序列比對并記錄堿基突變位點，發(fā)現(xiàn)44株捻轉(zhuǎn)血矛線蟲樣品ITS-1基因序列存在17個堿基突變位點，包括10個堿基顛換(A?C，n=2；A?T，n=1；T?G，n=5；C?G，n=2；)、10個堿基轉(zhuǎn)換(A?G，n=4； T?C，n=6)；ITS-2基因序列存在15個堿基突變位點，包括5個堿基顛換(T?A，n=3；C?G，n=1；T?G，n=1)、9個堿基轉(zhuǎn)換(A?G，n=5；T?C，n=4)和1個堿基插入。MegAlign結(jié)果顯示(部分蟲體樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2，圖3所示)，2015年—2020年間，陜西咸陽地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體樣本ITS-1序列種內(nèi)變異率為0～4.1%，ITS-2序列種內(nèi)變異率為0～6.3%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1～12.ITS基因PCR產(chǎn)物；13.陰性對照

圖2 陜西省咸陽地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲部分樣品ITS-1基因序列相似性分析

2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、ITS-2基因序列構(gòu)建ML樹(圖4、圖5)。ITS-1進(jìn)化樹中可以看出蟲體樣本SX15-1、SX20-6、SX19-10、SX20-10匯聚于進(jìn)化樹同一枝上；蟲體樣本SX17-3與來自陜西的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株(KX534100)匯聚于同一支上；蟲體樣本SX17-5與伊朗的分離株(HQ389229)最為接近。ITS-2進(jìn)化樹中，樣本SX15-8、SX17-9、SX17-11匯于同一支上，且與GenBank中來自陜西的分離株(KX534100)最為接近；樣本SX20-1與GenBank中來自尼日利亞的分離株(LC368048)最為接近；樣本SX17-5與GenBank中來自廣東的分離株(KM586652)最為接近。

3 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是危害反芻動物養(yǎng)殖業(yè)較為嚴(yán)重的寄生性線蟲，對畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展帶來了極大的隱患，研究其基因進(jìn)化可為尋找捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防治措施提供一定的理論依據(jù)。核糖體ITS基因作為遺傳進(jìn)化分析當(dāng)中一種重要的基因標(biāo)記，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于寄生蟲的物種分類以及遺傳進(jìn)化分析[8-10]。本研究對陜西省咸陽地區(qū)44株山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS基因序列進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)蟲體樣本ITS-1序列與GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1參考序列(登錄號LS997563)相似性為97.01%～99.75%；蟲體樣本ITS-2序列與GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2參考序列(登錄號LC368048)相似性為96.97%～100%，這些結(jié)果表明，2015年-2020年間陜西省咸陽地區(qū)山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1、ITS-2基因均有不同程度的遺傳變異發(fā)生，但未出現(xiàn)種群分化。另外，將44株樣本捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1和ITS-2序列分別進(jìn)行了兩兩比較，結(jié)果顯示，ITS-1和ITS-2基因的種內(nèi)變異率分別為0～4.1%和0～6.3%，ITS-2基因變異率要高于ITS-1基因，這與沈效平[12]關(guān)于湖南地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同源性差異(ITS-1為0～3.5%、ITS-2為0～5.8%)的報道相似。這些結(jié)果也表明，此地區(qū)羊源捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的ITS基因突變比較低，種內(nèi)的相似性較高，未發(fā)生明顯的遺傳進(jìn)化。

圖3 陜西省咸陽地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲部分樣品ITS-2基因序列相似性分析

圖4 基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹

在本試驗中，將各蟲體樣本ITS-1基因序列與GenBank中ITS-1參考序列(LS997563)作比較，發(fā)現(xiàn)存在17個堿基變異位點，其中位點225、262與Skorpikova L等[13]報道的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1序列變異位點一致，本研究中ITS-1其余突變位點還未見于其他報道中。樣本ITS-2序列與GenBank中ITS-2參考序列(LC368048)比較后，發(fā)現(xiàn)存在15個變異位點。18、21、22、63、123、196的變異情況與Shen D D、Dey A R、郭筱璐、Yin F等[14-17]的研究報道相一致。此外，42、61、101、106、112、138、158、160、227、229這10個位點在其他報道還未見到。

圖5 基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹

從構(gòu)建的ITS-1、ITS-2基因進(jìn)化樹可以看出，2015年-2020年間，樣本捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的遺傳進(jìn)化距離都較為接近，表明近6年內(nèi)，陜西省咸陽地區(qū)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲未出現(xiàn)新的種群分化，并且各國家和地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲遺傳進(jìn)化距離均較為接近。值得注意的是，在ITS-1進(jìn)化樹中，只有蟲株SX17-3與GenBank中陜西ITS-1序列(KX534100)匯聚在進(jìn)化樹同一支上，樣本SX17-5反而與伊朗的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-1序列(HQ389229)最為接近；在ITS-2進(jìn)化樹中，只有樣本SX15-8、SX17-9、SX17-11與陜西的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2序列(KX534100)較為接近，而樣本SX20-1、SX17-5分別與尼日利亞的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2序列(LC368048)、中國廣東的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2序列(KM586652)最為接近。這些結(jié)果表明，不同國家和地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲尚未出現(xiàn)新的種群分化，且ITS-1、ITS-2 rDNA的遺傳進(jìn)化與不同地理條件之間的相關(guān)性不明顯，這與嚴(yán)若峰、林海、蒲善秋等[2,18-19]報道的結(jié)果一致。