傅彩霞，張啟龍，劉?，?，栗云鵬，張 瑋，王 林，張 躍，李 剛，劉曉冬，周德剛

(北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的單股負鏈環(huán)狀DNA 病毒。PCV主要包括3個基因型，即豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus 3，PCV3)。PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated diseases，PCVAD)的主要病原，這些疾病以PCV2臨床感染或亞臨床感染為主要特征，主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、豬呼吸道綜合征、繁殖障礙和仔豬先天性震顫等[1]。PCV2在豬群中的感染率很高，雖然PCV2單純感染的豬通常以亞臨床感染為主，但是PCV2產(chǎn)生的免疫抑制使其他病原更易感染，臨床中PCV2與其他病原混合感染日趨嚴(yán)重，混合感染的豬會出現(xiàn)更為明顯的臨床癥狀，且會造成豬的死亡，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。PCV2的基因組大小為1 766 bp～1 768 bp[2]。目前發(fā)現(xiàn)PCV2有6個基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e和PCV2f。PCV2在世界范圍內(nèi)的廣泛流行，使得PCV2流行毒株的基因亞型持續(xù)發(fā)生演變，讓流行形勢變得更為復(fù)雜。因此，為了解目前北京市種豬群中PCV2的感染流行情況及流行毒株的遺傳變異規(guī)律，本研究對2019年-2020年從北京市4個區(qū)種豬場采集的豬抗凝血進行了PCV2熒光PCR檢測，并對 9份PCV2 陽性樣本進行了全基因組序列的測定與分析，這對進一步完善加強北京地區(qū)PCV的防控，制定更為科學(xué)合理的防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 2019至2020年間，在北京市的順義、密云、昌平、延慶等4個區(qū)的所有種豬場采集抗凝血，每季度采樣一次，每場每次采集樣本70份，共計采集種豬抗凝血7 030份。

1.1.2 主要試劑 磁珠法病毒核酸提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測試劑盒，哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；pXT19-T載體，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取/純化試劑盒、PstⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶，為Promega公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 熒光PCR儀(QuantStudio 7)，美國ABI公司產(chǎn)品；PCR儀(SimpliAmp)，美國ABI公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(5430R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸提取儀(TGuide S32)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(GelDoc XR)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.4 PCV2全基因組擴增引物的設(shè)計與合成 參照文獻[3]設(shè)計合成引物。該引物用于PCV2全基因組序列擴增，PCV2-CF：5′-GGAAGCTTCAGTAATTTATTTCATATGGAA-3′，PCV2-CR：5′-GGAA GCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTT-3′，目的片段長度為1 766 bp/1 767 bp/1 768 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取 按照磁珠法病毒核酸提取試劑盒說明書的操作步驟提取病毒DNA。

1.2.2 臨床樣本PCV2熒光PCR檢測 將提取的DNA進行熒光PCR檢測，PCR反應(yīng)體系為20 μL：無菌無核酸酶水4 μL，PCR反應(yīng)液10 μL，熒光探針4 μL，DNA溶液2 μL，將上述溶液混勻、瞬時離心。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 35 s，共 40個循環(huán)，在每個循環(huán)第二步(60℃ 35 s)收集熒光信號。PCV2報告熒光設(shè)定為FAM，淬滅熒光設(shè)定為None。

1.2.3 PCV2全基因組PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μL：無菌無核酸酶水35.5 μL，5ⅹbuffer 10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L各種引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA溶液2 μL，將上述溶液混勻、瞬時離心。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35個循環(huán)；68℃延伸7 min。

1.2.4 DNA片段的回收與純化 在12 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物，切下目的條帶，用DNA回收純化試劑盒對DNA片段進行回收純化，回收純化產(chǎn)物溶解于50 μL無菌去離子水中，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與基因測序 將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到 pXT19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp、IPTG及X-gal篩選，挑取白色單菌落，過夜振搖培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)PstⅠ+KpnⅠ或BamHⅠ+SalⅠ雙酶切鑒定為陽性后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6 序列分析 利用DNAStar分析軟件對本研究的9個PCV2流行毒株和GenBank中已發(fā)表的PCV2參考毒株的全基因組序列和ORF2序列進行核苷酸、氨基酸同源性比較及遺傳進化情況分析。

表1 PCV2參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本的PCV2熒光PCR檢測

為了解目前北京市種豬群中PCV2的感染流行情況，對2019年-2020年間采集的來自北京順義、密云、昌平和延慶等4個區(qū)的7 030份種豬抗凝血樣本進行了PCV2熒光PCR檢測。結(jié)果顯示，PCV2感染的總陽性率為21.41%；2019年-2020年，PCV2感染的陽性率分別為17.58%和23.78%，呈逐年上升趨勢；一季度和二季度，PCV2感染的陽性率稍高于三季度和四季度，但不同季節(jié)的感染陽性率并沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化。結(jié)果表明PCV2在北京市的種豬群中具有較高的感染率(表2)。

表2 2019年-2020年北京地區(qū)種豬群PCV2感染情況統(tǒng)計

2.2 PCV2全基因組擴增

9份PCV2陽性樣本分別命名為BJ11.19、BJ12.20、BJ17.20、BJ18.19、BJ21.19、BJ24.20、BJ25.20、BJ26.19和BJ27.20。將 9份PCV2陽性樣本進行了PCV2全基因組擴增。結(jié)果顯示，9份樣品分別擴增出了1條大小為1 767 bp左右的條帶，與預(yù)計結(jié)果相符(圖1)。

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用PstⅠ+KpnⅠ或BamHⅠ+SalⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。PstⅠ+KpnⅠ雙酶切：BJ11.19、BJ12.20、BJ17.20、BJ18.19；BamHⅠ+SalⅠ雙酶切：BJ21.19、BJ24.20、BJ25.20、BJ26.19、BJ27.20，酶切出的2條帶與預(yù)期的長度一致(圖2)。

M.DNA Marker; 1～4.樣品；5.陰性對照；6～10.樣品M.DNA Marker; 1-4.Samples; 5.Negative control; 6-10.Samples

2.4 重組質(zhì)粒的DNA 序列測定與分析

對鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序，測得插入片段的核苷酸序列全長：BJ11.19為1 766 bp，BJ12.20為1 767 bp，BJ17.20為1 768 bp，BJ18.19為1 767 bp，BJ21.19為1 767 bp，BJ24.20為1 766 bp，BJ25.20為1 767 bp，BJ26.19為1 767 bp，BJ27.20為1 767 bp。應(yīng)用DNAStar分析軟件對本研究的9個PCV2流行毒株和GenBank中已發(fā)表的17株P(guān)CV2參考毒株的全基因組序列和ORF2序列進行了同源性比較及遺傳進化情況分析，結(jié)果見圖3、4、5。

2.4.1 全基因組核苷酸序列分析及同源性比較 本研究的9個PCV2流行毒株之間全基因組序列的核苷酸同源性為94.0%～99.9%；與吳惠明等[4]分離的2個北京株BJ2010LC株(登錄號為JQ002671)、BJ2010PG株(登錄號為JQ002672)之間的核苷酸同源性為93.8%～98.8%；與9株來自中國不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間的核苷酸同源性為94.0%～99.4%；與6株來自世界不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間的核苷酸同源性為90.4%～98.8%。

M.DNA Marker；1、3、5、7、9、11、13、15、17.重組質(zhì)粒；2、4、6、8、10.重組質(zhì)粒BamHⅠ+SalⅠ酶切；12、14、16、18.重組質(zhì)粒PstⅠ+KpnⅠ酶切

圖3 9株P(guān)CV2流行株與17株參考株全基因組核苷酸序列同源性分析

2.4.2 全基因組遺傳進化關(guān)系分析 將本研究的9個PCV2流行毒株和GenBank中已發(fā)表的17個PCV2參考毒株的全基因組核苷酸序列分析結(jié)果繪制了PCV2遺傳進化樹。所繪制的遺傳進化樹分為5個基因組群，本研究的9個PCV2流行毒株分屬于PCV2a、PCV2b和PCV2d 3個基因亞型，其中BJ11.19、BJ17.20和BJ18.19均屬于PCV2a亞型，與加拿大AF055392、中國AY181948、AF381175、MK347388等毒株屬于同一基因亞型；BJ21.19、BJ24.20、BJ25.20、BJ26.19和BJ27.20均屬于PCV2b亞型，與法國AF055394、中國AY391729、AY181945、MK347362及中國(北京)JQ002672等毒株屬于同一基因亞型；BJ12.20屬于PCV2d亞型，與中國EF524517、HM038017、MK347412及中國(北京)JQ002671等毒株屬于同一基因亞型。結(jié)果顯示，本研究監(jiān)測的北京市種豬群中的PCV2流行毒株以PCV2a、PCV2b和PCV2d這3個基因亞型共存為主，但PCV2a和PCV2b為優(yōu)勢基因型。

圖4 PCV2全基因組遺傳進化樹

圖5 9株P(guān)CV2流行株與17株參考株ORF2氨基酸序列同源性分析

2.4.3 ORF2核苷酸及氨基酸序列分析與同源性比較 將本研究獲得的9個PCV2流行毒株全基因組序列用ORF Finder尋找ORF2開放閱讀框，并對ORF2基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行同源性分析與比較。結(jié)果顯示，本研究的9個PCV2流行毒株之間ORF2核苷酸序列及其編碼氨基酸的同源性分別為89.0%～100%和86.7%～100%；與2個北京株BJ2010LC株(登錄號為JQ002671)、BJ2010PG株(登錄號為JQ002672)之間ORF2核苷酸序列及其編碼氨基酸的同源性分別為88.3%～99.0%和86.7%～98.7%；與9株來自中國不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間ORF2核苷酸序列及其編碼氨基酸的同源性分別為89.0%～99.9%和87.1%～100%；與6株來自世界不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間ORF2核苷酸序列及其編碼氨基酸的同源性分別為80.2%～99.3%和79.8%～98.7%。本研究獲得的9個PCV2流行毒株的ORF2長度為702 bp或705 bp，其中1株(BJ12.20毒株，PCV2d亞型)ORF2長度為705 bp，編碼234個氨基酸，其余8個PCV2流行毒株的ORF2長度均為702 bp，編碼233個氨基酸。氨基酸序列分析表明，9株P(guān)CV2流行毒株ORF2編碼的Cap蛋白共存在36處氨基酸變異位點，即第6、8、19、22、47、53、57、59、63、68、72、76、77、80、86、88、89、90、91、98、109、121、123、131、133、134、136、138、151、169、185、190、191、206、210、215位，不同基因亞型毒株之間Cap蛋白表位區(qū)域的突變存在差異，每個PCV2亞型都有其特異的氨基酸變異位點，這些區(qū)域的突變對毒株的抗原性是否產(chǎn)生影響還有待進一步研究。比對發(fā)現(xiàn)，BJ12.20毒株(PCV2d亞型)在Cap蛋白的C末端終止密碼子之前增加了一個賴氨酸(K)，該變化可能會對毒株的抗原性和致病性產(chǎn)生影響[5]。

3 討論

PCV2感染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，近年來中國的多個省份相繼檢測出豬群中PCV2感染的高陽性率，PCV2感染引發(fā)的相關(guān)疾病，造成生豬生產(chǎn)性能下降甚至死亡，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。蔣新華等[6]對2013年-2017年江西省10個地區(qū)豬群中PCV2感染情況進行了調(diào)查，其總陽性率為56.4%。鄧文芳等[7]對2017年-2018年華中地區(qū)湖北省、湖南省和河南省的豬群PCV2感染情況進行了流行病學(xué)調(diào)查，總陽性率為68.53%。呂其壯等[8]對2016年廣西北部灣地區(qū)規(guī)模豬場和農(nóng)村散養(yǎng)戶豬圓環(huán)病毒2型感染情況進行了調(diào)查，PCV2感染總陽性率為42.16%。劉玄福等[9]對2015年-2017年間收集的河北北部豬場86份臨床病料進行了PCV2檢測，陽性率為44.19%。本研究對2019年-2020年間采集的來自北京順義、密云、昌平和延慶等4個區(qū)的7 030份種豬抗凝血樣本進行了PCV2熒光PCR檢測，PCV2感染的總陽性率為21.41%；2019年和2020年，PCV2感染的陽性率分別為17.58%和23.78%，呈逐年上升趨勢；一季度和二季度，PCV2感染的陽性率稍高于三季度和四季度，但不同季節(jié)的感染陽性率并沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化；結(jié)果表明PCV2在北京市的種豬群中具有較高的感染率。近年隨著生豬養(yǎng)殖規(guī)模的恢復(fù)，養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變，疫病防控的難度增大，PCV2感染引發(fā)的相關(guān)疾病造成的危害也會日趨嚴(yán)重，應(yīng)引起高度重視，進一步加強PCV2的有效防控。

本研究獲得的9個PCV2全基因組序列，其中2株基因組全長為1 766 bp，6株基因組全長為1 767 bp，1株基因組全長為1 768 bp。9個PCV2流行毒株之間全基因組序列的核苷酸同源性為94.0%～99.9%；與2011年北京株BJ2010LC株、BJ2010PG株之間的核苷酸同源性為93.8%～98.8%；與9個來自中國不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間的核苷酸同源性為94.0%～99.4%；與6個來自世界不同地區(qū)的PCV2參考毒株之間的核苷酸同源性為90.4%～98.8%。同源性分析結(jié)果表明，北京市近期流行的9個PCV2毒株相互之間的同源性較高，與2011年北京株、9個來自中國不同地區(qū)的參考毒株、6個來自世界不同地區(qū)的參考毒株之間也具有較高的同源性，說明北京市PCV2基因遺傳變異不大，較為保守。

目前PCV2分為6個基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e和PCV2f。最初 PCV2 感染豬中檢測到較多的為PCV2a亞型，2003年后豬群中的流行毒株為PCV2b亞型，2012年后，出現(xiàn)PCV2d基因亞型感染增多的趨勢。目前我國流行的主要為PCV2a、PCV2b和PCV2d 3種基因亞型毒株[10]。本研究的9株P(guān)CV2分屬于PCV2a、PCV2b和PCV2d這3個基因亞型，其中有3株屬于PCV2a亞型，5株屬于PCV2b亞型，1株屬于PCV2d亞型。

PCV2包含11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中ORF1、5、7、10定義為正向，ORF2、3、4、6、8、9、11定義為負向[11]。ORF2為702、705nt，編碼衣殼蛋白Cap。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的抗原決定簇，與病毒的致病性有關(guān)，是刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要靶抗原。雖然PCV2分子序列較為保守，但依然存在變異。各毒株之間的差異主要是ORF1和ORF2高變異區(qū)堿基的改變，ORF1的突變位點較少，ORF2的突變位點較多,突變頻率較快。本研究的9個PCV2流行毒株的ORF2長度為702 bp或705 bp，其中1株(BJ12.20毒株，PCV2d亞型)ORF2長度為705 bp，編碼234個氨基酸，其余8個PCV2毒株的ORF2長度均為702 bp，編碼233個氨基酸。有研究表明，編碼234個氨基酸的PCV2衣殼蛋白比編碼233個氨基酸的PCV2a/ PCV2b株的致病性要強[5]。氨基酸序列分析表明，9個PCV2流行毒株ORF2編碼的Cap蛋白共存在36處氨基酸變異位點，主要變異位點與多名學(xué)者研究揭示的Cap蛋白上存在53-91、121-151、190-210 aa變異度較高區(qū)域的研究結(jié)果相一致[12]。在本研究中，比對顯示，不同基因亞型毒株之間Cap蛋白表位區(qū)域的突變存在差異，每個PCV2亞型都有其特異的氨基酸變異位點，這些區(qū)域的突變對毒株的抗原性是否產(chǎn)生影響還有待進一步研究。BJ12.20毒株(PCV2d亞型)在Cap蛋白的C末端終止密碼子之前增加了一個賴氨酸(K)，該變化可能會對毒株的抗原性和致病性產(chǎn)生影響。本研究明確了北京市種豬群中PCV2感染現(xiàn)狀及流行毒株的分子流行病學(xué)特點、遺傳演化情況，為今后更為有效預(yù)防控制PCV2感染提供了參考。