成偉偉，楊軍祥，常攀峰，李元新，陳伯祥，趙子惠，楊 明，常 亮

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000)

羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起綿羊和山羊的傳染性膿皰(contagious ecthyma)[1-2]。羊傳染性膿皰的主要臨床癥狀為被感染羊只的鼻和嘴唇部位形成水皰、膿皰和結(jié)痂。該病毒對羔羊危害巨大，1周齡內(nèi)的羔羊被感染后病死率很高[3]。該病嚴重威脅養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展[4]。ORFV為雙鏈DNA病毒，核酸大小為134 kb～139 kb，基因組分為核心區(qū)和變異區(qū)，變異區(qū)主要與病毒毒力、宿主和抗免疫相關(guān)[5-8]。ORFV的抗干擾素基因(Orf virus anti-interferon,VIR)位于基因組的核心區(qū)，具有較高的保守性，ORFV編碼的VIR蛋白在體外試驗中表現(xiàn)出了拮抗干擾素的活性，是通過抑制PKR的功能實現(xiàn)的[9-10]。在ORFV感染宿主的過程中，VIR蛋白發(fā)揮著怎樣的功能，目前還不清楚，病毒感染是一套非常精細的過程，每個基因和蛋白都發(fā)揮了重要的作用，對VIR蛋白功能的進一步研究有助于闡明羊口瘡病毒的致病機制?；诖?，本研究擴增了ORFV的VIR基因，構(gòu)建了VIR的熒光蛋白真核表達載體，轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞并檢測VIR與EGFP融合蛋白的熒光表達，用Western blot檢測了VIR蛋白的生物活性，通過生物信息學方法進行了VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與細胞表位預(yù)測，為VIR蛋白功能研究和羊口瘡病毒的致病機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、毒株和細胞株 質(zhì)粒pVAX1，ThermoFisher公司產(chǎn)品；ORFV毒株、BHK-21細胞、T-EGFP載體，本實驗室保存。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀、電泳儀、核酸凝膠成像系統(tǒng)，杭州朗基科學儀器有限公司產(chǎn)品；控溫搖床，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科公司產(chǎn)品；蛋白轉(zhuǎn)膜儀，伯樂公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡，Thermo Fisher 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1VIR基因和EGFP基因的擴增 根據(jù)GenBank中公布的VIR基因序列和EGFP基因序列以及載體pVAX1的酶切位點，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計去掉終止密碼子的VIR基因的真核表達引物和EGFP基因的引物(表1)，進行PCR擴增并回收[8,11]。

表1 VIR基因與EGFP基因的引物序列

1.2.2 pVAX1-EGFP真核表達載體的構(gòu)建 進行EGFP基因和載體pVAX1的BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，進行回收、連接、轉(zhuǎn)化、平板培養(yǎng)和挑取單菌落搖菌培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序鑒定[12]。

1.2.3 pVAX1-VIR-EGFP真核表達載體的構(gòu)建 進行VIR基因和質(zhì)粒pVAX1-EGFP的Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，進行回收、連接、轉(zhuǎn)化、平板培養(yǎng)和挑取單菌落搖菌培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序鑒定[12]。

1.2.4 重組蛋白的熒光檢測 參照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)BHK-21細胞。參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將4 μg重組pVAX1-VIR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，同時設(shè)置陰性對照，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 重組蛋白的生物活性檢測 收集1.2.4中轉(zhuǎn)染重組pVAX1-VIR-EGFP質(zhì)粒的BHK-21細胞，進行SDS-PAGE電泳和Western blot試驗，一抗為ORFV的全病毒血清，二抗為HRP標記的鼠抗山羊IgG[12]，具體步驟參照分子生物學實驗指導(dǎo)進行。

1.2.6 VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析和細胞表位預(yù)測 使用Swiss-Model和RasMol軟件分析構(gòu)建VIR蛋白和VIR與EGFP融合蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型[13-14]；運用IEDB預(yù)測VIR蛋白B細胞表位，設(shè)定閾值為0.5；運用SYFPEITHI和IEDB分析預(yù)測VIR蛋白的HLA-A*0201限制性CTL優(yōu)勢表位[15-16]。

2 結(jié)果

2.1 VIR基因和EGFP基因的擴增

擴增結(jié)果見圖1和圖2,與預(yù)期大小相符，VIR基因的退火溫度為59℃，EGFP基因的退火溫度為58℃。

2.2 pVAX1-EGFP真核表達載體的構(gòu)建

雙酶切結(jié)果顯示約2 999 bp和720 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)，測序驗證正確，表明載體pVAX1-EGFP構(gòu)建成功[8]。

M.DNA標準DL 2 000；1.VIR基因M.DNA Marker DL 2 000;1.VIR gene

M.DNA標準DL 2 000；1.EGFP基因M.DNA Marker DL 2 000; 1.EGFP gene

2.3 pVAX1-VIR-EGFP真核表達載體的構(gòu)建

將VIR基因克隆至載體pVAX1-EGFP中，命名為pVAX1-VIR-EGFP。Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切結(jié)果顯示約3 719 bp和549 bp的片段，與預(yù)期相符；進行Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切電泳顯示約2 999 bp和1 269 bp的載體和目的片段，與預(yù)期相符(圖4)，測序驗證正確，表明載體pVAX1-VIR-EGFP構(gòu)建成功[8]。

M.DNA標準DL 5 000；1.pVAX1-EGFP的BamHⅠ+EcoRⅠ酶切產(chǎn)物

2.4 重組蛋白的熒光檢測

在熒光顯微鏡下對比觀察轉(zhuǎn)染pVAX1-EGFP載體的BHK-21細胞、轉(zhuǎn)染pVAX1-VIR-EGFP載體的BHK-21細胞、轉(zhuǎn)染空載體的BHK-21細胞和未轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pVAX1-EGFP載體的BHK-21細胞和轉(zhuǎn)染pVAX1-VIR-EGFP載體細胞可見明顯的綠色熒光(圖5)，轉(zhuǎn)染pVAX1-EGFP的細胞熒光稍強于轉(zhuǎn)染pVAX1-VIR-EGFP的細胞熒光，說明重組蛋白VIR+EGFP成功表達。

M.DNA標準DL 5 000；1.pVAX1-VIR-EGFP的Hind Ⅲ+BamHⅠ酶切產(chǎn)物；2.pVAX1-VIR-EGFP的Hind Ⅲ+EcoRⅠ酶切產(chǎn)物

A．轉(zhuǎn)染pVAX1-VIR-EGFP 的BHK-21細胞；B.轉(zhuǎn)染pVAX1-EGFP 的BHK-21細胞；C.轉(zhuǎn)染pVAX1 的BHK-21細胞；D.正常細胞

2.5 重組蛋白的生物活性檢測

Western blot結(jié)果顯示了與預(yù)計相符的53 ku左右的融合蛋白條帶，陰性對照未出現(xiàn)(圖6)，表明融合蛋白具有較高的特異性。

2.6 VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析和細胞表位預(yù)測

運用Swiss-Model軟件分析構(gòu)建出VIR蛋白和VIR與EGFP融合蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型，見圖7，VIR蛋白形狀呈錐體，VIR與EGFP融合蛋白形狀呈橢圓，中間呈藍色，直觀的反映出了二者的差異。運用IEDB軟件預(yù)測出VIR蛋白的優(yōu)勢B細胞抗原表位為14-20、29-106、 127-138 、 151-161位氨基酸。運用SYFPEITHI和IEDB軟件預(yù)測篩選出VIR蛋白的HLA-A*0201限制性CTL優(yōu)勢表位3個，見表2。

M．蛋白分子質(zhì)量標準；1.融合蛋白；2.陰性對照

A.VIR蛋白；B.融合蛋白A.VIR protein; B.Fusion protein

表2 SYFPEITHI和IEDB方法對VIR蛋白CTL表位預(yù)測

3 討論

VIR蛋白作為羊口瘡病毒的主要毒力蛋白，在羊口瘡病毒跨種感染和免疫逃避方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。在ORFV感染GSF細胞試驗中，VIR蛋白能夠抑制IFN-α的表達，p53是I型干擾素信號通路相關(guān)蛋白，能夠抑制新城疫、副流感病毒的復(fù)制[19,20]。在ORFV感染宿主的過程中，VIR蛋白究竟還發(fā)揮怎樣的作用，目前還不可知，對VIR蛋白的深入研究，有助于揭示ORFV感染機制，ORFV在感染過程中，有許多精細和神奇之處，如ORFV編碼的VEGF對痂皮形成、病毒的免疫逃避、病毒的散播等發(fā)揮著重要作用，對VEGF的進一步研究有助于在解決腫瘤血管生成和創(chuàng)傷康復(fù)等方面的問題[21]。本研究將ORFV的VIR基因與EGFP綠色熒光蛋白基因融合克隆至載體pVAX1上，轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞進行了融合表達，結(jié)果顯示， EGFP表達的綠色熒光強于EGFP與VIR融合表達的綠色熒光，融合表達的綠色熒光在BHK-21細胞中呈散點狀分布，說明VIR與EGFP融合表達中，VIR蛋白將EGFP蛋白的部分綠色熒光覆蓋或遮擋，但未影響EGFP基因的表達。將構(gòu)建的pVAX1-VIR-EGFP 載體轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，進行Western blot試驗，一抗是ORFV感染羊的全病毒血清，二抗是鼠抗山羊IgG，最終檢測出了53 ku左右的融合蛋白條帶，與預(yù)期相符，一抗ORFV全病毒血清能夠與融合蛋白反應(yīng)，說明表達的融合蛋白保持了一定的生物活性，這也反應(yīng)出了真核表達的優(yōu)點。

應(yīng)用生物信息學軟件對VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)和細胞表位進行了分析預(yù)測，VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)形似一個椎體，上大下小，VIR和EGFP融合蛋白形似橢圓，中間部分呈現(xiàn)藍色，這一點也直觀的反映出了EGFP綠色熒光蛋白的作用，三級結(jié)構(gòu)圖與熒光顯微鏡檢測圖相互呼應(yīng)，互相印證，通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測直觀的展示出了VIR蛋白的形態(tài)，有助于與相關(guān)蛋白進行一個直觀的比較以及進一步探究該蛋白質(zhì)的功能位點等。優(yōu)勢B細胞抗原表位為14-20、29-106、 127-138 、 151-161位氨基酸，其中29-106位氨基酸是最大的一段B細胞抗原表位，這可能與VIR蛋白的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)型有關(guān)系，而CTL優(yōu)勢表位只有3段，未預(yù)測出Th優(yōu)勢表位，這表明ORFV在感染宿主機體過程中，VIR蛋白主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫，這也為ORFV亞單位疫苗研發(fā)提供了方向。