李晨露，吳發(fā)興，徐海玲，許信剛*，張 琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家動(dòng)物血清庫，山東青島 266114)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)引起的一種傳染病，臨床特征為排淡黃色水樣糞便，且伴隨發(fā)熱、精神萎靡、食欲不振、奶牛產(chǎn)奶量下降等癥狀[1-2]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，BCoV的感染率可達(dá)50%～100%，通常與輪狀病毒混合感染[3]。BCoV多感染水牛和牛，偶爾也可感染人引起發(fā)病[4]，主要通過呼吸道和消化道傳播，該病呈地方性流行，具有明顯的季節(jié)性，一般冬春季節(jié)發(fā)病較多[5]。我國作為世界上的養(yǎng)牛大國，近年來隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，牛冠狀病毒病的流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，給我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了巨大影響。目前，臨床上檢測(cè)BCoV的方法主要有病毒分離培養(yǎng)、PCR檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和中和試驗(yàn)等。上述方法中以ELISA為最有效的檢測(cè)方法，該方法操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏性高，而其他方法或特異性不強(qiáng)，或靈敏性低，難以在臨床上推廣應(yīng)用[6]。因此，開展牛冠狀病毒的檢測(cè)及防控技術(shù)研究十分必要。本研究旨在采用BCoV中反應(yīng)原性較好的N蛋白作為包被抗原，建立一種快速檢測(cè)BCoV抗體的間接ELISA方法，進(jìn)一步豐富BCoV的檢測(cè)技術(shù)，為BCoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株與質(zhì)粒 BCoV陜西分離株由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存[7]。pGM-T載體試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；pET-28a(+)載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 血清樣品 BCoV陽性血清和陰性血清為中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家動(dòng)物血清庫提供；牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品均為購買的ELISA試劑盒中的陽性血清樣品；用于臨床檢測(cè)的296份奶牛血清樣品采自陜西省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)。

1.1.3 主要試劑 Trizol、膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、TMB顯色液，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶，NEB公司產(chǎn)品； 2×EsTaqMasterMix，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶，TaKaRa公司產(chǎn)品； HRP-Goat-Anti-Bovine IgG，JACKSON公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Genesy 96T)，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器(THZ-C)，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全波長多功能酶標(biāo)儀(XSP-37XBY)，上海光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上收錄的牛冠狀病毒N基因序列(MK903505.1)使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物(表1)。

表1 牛冠狀病毒N基因引物序列

1.2.2 N基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 使用Trizol法提取BCoV陜西分離株病毒全基因組核酸，以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×ESTaqMasterMix 25 μL ，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將目的片段與pET-28a連接并測(cè)序，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-28a-N。

1.2.3 重組N蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 經(jīng)測(cè)序鑒定后，將重組質(zhì)粒pET-28a-N轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，次日按照1∶50的量轉(zhuǎn)接到Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期時(shí)(約2 h)加入終濃度為1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h，離心收集菌體，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

在最佳誘導(dǎo)時(shí)間下，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化，按照1∶50的量轉(zhuǎn)接到Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期時(shí)(約2 h)加入終濃度為1、0.8、0.6、0.4、0.2 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體，確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.4 重組N蛋白表達(dá)形式分析、純化及復(fù)性 在最佳誘導(dǎo)條件下，進(jìn)行大量誘導(dǎo)，離心收集菌體，經(jīng)超聲裂解后，分別取裂解后菌體上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定重組N蛋白的表達(dá)形式。采用鎳柱法純化重組N蛋白，按照文獻(xiàn)[8]中步驟對(duì)純化的重組N蛋白進(jìn)行復(fù)性，分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組N蛋白的Western blot分析 將復(fù)性N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜并封閉2 h后，加入1∶200稀釋的BCoV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清置于4℃過夜孵育，次日洗膜后置入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗牛IgG，在室溫下孵育2 h。ECL顯色液孵育后曝光，進(jìn)行分析。

1.2.6 間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

1.2.6.1 抗原包被量、血清和酶標(biāo)二抗稀釋度的確定 采用方陣滴定法來確定，N蛋白包被濃度分別為0.75、1.5、3 μg/mL；陰陽性血清以1∶50、1∶100、1∶200稀釋；酶標(biāo)二抗稀以1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀釋，按照文獻(xiàn)[8]間接ELISA步驟操作，將P/N最大值確定為抗原、血清和酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

1.2.6.2 其他試驗(yàn)條件的優(yōu)化 確定抗原包被量、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度后，以50 mL/L山羊血清、50 g/L脫脂奶粉和25 g/L脫脂奶粉進(jìn)行封閉液的優(yōu)化，以60 min、90 min、120 min進(jìn)行封閉時(shí)間的優(yōu)化，以30 min、60 min、90 min進(jìn)行血清孵育時(shí)間的優(yōu)化，以30 min、60 min、90 min進(jìn)行酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間的優(yōu)化，以10 min、20 min、30 min進(jìn)行顯色時(shí)間的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.6.4 特異性試驗(yàn) 對(duì)牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立BCoV陰陽性對(duì)照，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行評(píng)估。

1.2.6.5 靈敏性試驗(yàn) 分別以1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120稀釋BCoV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品后進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該方法的靈敏性進(jìn)行評(píng)估。

1.2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批純化復(fù)性的N蛋白作為包被抗原，分別取BCoV陰、陽性血清各3份，每份血清樣品重復(fù)3次，測(cè)定其OD450 nm值，根據(jù)變異系數(shù)來評(píng)價(jià)批內(nèi)重復(fù)性。采用3份不同批次純化復(fù)性的N蛋白作為包被抗原，分別取BCoV陰陽性血清各3份，每份血清樣品重復(fù)3次，測(cè)定其OD450 nm值，評(píng)價(jià)批間重復(fù)性。

1.2.6.7 臨床樣品檢測(cè) 采用本試驗(yàn)建立的ELISA檢測(cè)方法，對(duì)陜西省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)隨機(jī)收集的296份奶牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 N基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以BCoV陜西分離株cDNA為模板， PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳分析得到了與預(yù)期片段大小一致的N基因片段(圖1)，將所獲得的重組質(zhì)粒pET-28a-N經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，酶切結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖2)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.N基因的擴(kuò)增M.DNA Marker DL 2 000；1.Amplification of N gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.重組質(zhì)粒pET-28a-N經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

2.2 重組N蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

在不同誘導(dǎo)時(shí)間下，37℃誘導(dǎo)6 h時(shí)重組N蛋白的表達(dá)量最高(圖3)。另外，重組N蛋白表達(dá)量的影響在不同IPTG終濃度下變化不大。

M.預(yù)染蛋白Marker；1.誘導(dǎo)的pET-28a；2.未誘導(dǎo)的重組pET-28a-N；3～6.分別為37℃、1 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h的重組PET-28a-N

2.3 重組蛋白表達(dá)形式的分析及純化

在最佳誘導(dǎo)條件下收集菌體，經(jīng)超聲裂解后，重組N蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)，經(jīng)鎳柱純化后，獲得了大小為50 ku的目標(biāo)蛋白(圖5)。

M.預(yù)染蛋白Marker；1.誘導(dǎo)的pET-28a；2.未誘導(dǎo)的重組pET-28a-N；3.pET-28a-N超聲裂解菌體上清；4.pET-28a-N超聲裂解菌體沉淀

2.4 重組蛋白的Western blot分析

經(jīng)Western blot分析得到了50 ku的BCoV重組N蛋白特異性條帶，表明重組N蛋白能與BCoV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖6)。

2.5 抗原、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

由表2可知，重組N蛋白最佳包被量為1.5 μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶50，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶10 000，此時(shí)P/N值最大。

M.預(yù)染蛋白Marker；1.誘導(dǎo)的pET-28a；2.未誘導(dǎo)的重組pET-28a-N；3.未純化的重組PET-28a-N；4.純化的重組pET-28a-N

M.預(yù)染蛋白Marker；1、2.重組N蛋白；3.陰性對(duì)照

2.6 其他試驗(yàn)條件的優(yōu)化

結(jié)果表明，最佳封閉液為50 mL/L山羊血清，最佳封閉時(shí)間為120 min，血清最佳孵育時(shí)間為90 min，酶標(biāo)二抗最佳孵育時(shí)間為60 min，最佳顯色時(shí)間為10 min。

2.7 間接ELISA臨界值的確定

2.8 特異性試驗(yàn)

在最佳ELISA反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)牛病毒性腹瀉病毒陽性血清(OD450 nm=0.129)、牛輪狀病毒陽性血清(OD450 nm=0.118)、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性血清(OD450 nm=0.154)、口蹄疫病毒陽性血清(OD450 nm=0.131)檢測(cè)均為陰性，特異性良好。

2.9 靈敏性試驗(yàn)

在最佳ELISA反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋度為1∶2 560時(shí)，OD450 nm值為0.265，大于臨界值0.256，靈敏性可達(dá)到1∶2 560，靈敏性良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

在最佳ELISA反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.83%～5.80%和2.34%～7.45%，均小于10%，重復(fù)性良好。

表2 最佳抗原包被量、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度的確定

2.11 臨床樣品的檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的BCoV間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)陜西省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)隨機(jī)采集的296份奶牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中54份血清樣品呈陽性，陽性率為18.24%。

3 討論

牛冠狀病毒病呈世界性分布，在我國流行范圍廣，不同地方都有流行[9-10]。1周齡以內(nèi)的犢牛最為易感且發(fā)病率高、病死率高，而成年牛的發(fā)病率高，但病死率較低，感染后的病牛長期帶毒并且可在排毒期造成大規(guī)模的持續(xù)感染，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前BCoV尚無有效的治療藥物和疫苗，因此該病的檢出對(duì)其防控具有極為重要的意義。

鑒于BCoV 的N基因具有較高的保守性，其氨基酸序列在不同毒株中的同源性較高，因此，將N蛋白用于ELISA檢測(cè)方法的包被抗原，可獲得較為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果[11]。本研究采用鎳柱純化的方法對(duì)BCoV的重組N蛋白進(jìn)行純化，可得到親和力較好的活性蛋白，經(jīng)Western blot方法驗(yàn)證，重組蛋白的抗原性良好，將此重組蛋白用作診斷抗原具有極高的可行性，為下一步研制BCoV 抗體間接ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過對(duì)BCoV陜西分離株N基因的克隆，利用原核表達(dá)制備的重組N蛋白作為包被抗原，建立間接ELISA檢測(cè)方法，該方法特異性和靈敏性都較好。采用本試驗(yàn)建立的BCoV抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)陜西省不同地區(qū)牛場(chǎng)隨即采集的296份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，陽性率為18.24%。說明陜西省部分地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)BCoV感染率較高，可能與養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生、飼養(yǎng)密度有關(guān)[12]，應(yīng)該引起養(yǎng)殖場(chǎng)的高度重視。