吉士東， 王 麗， 胡啟國， 楊愛梅

(1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 河南 南陽 473061；2.商丘市農(nóng)林科學(xué)院， 河南 商丘 476000)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]隸屬于旋花科甘薯屬，是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物之一[1]。遺傳上甘薯有高度雜合、種間與種內(nèi)雜交不親和以及遺傳資源缺乏等特點(diǎn)[2]，因此其遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，病毒病、病蟲害危害也較為嚴(yán)重，制約了甘薯品種在遺傳方面的改良。目前世界上分布著甘薯屬600～700個(gè)物種[1,3-4]，甘薯近緣野生資源非常豐富。甘薯近緣野生種具有抗逆、抗蟲、抗病等優(yōu)良基因[2,5]，與甘薯遺傳性狀的差別較大，因此利用甘薯近緣野生種與甘薯品種進(jìn)行雜交，為擴(kuò)大甘薯基因庫及改良甘薯遺傳性狀等方面提供了重大的基因資源來源。將甘薯近緣野生種與甘薯品種進(jìn)行雜交時(shí)，常要求它們的染色體組一定相同或大致相同。張必泰等[6]指出，甘薯屬植物的染色體基數(shù)雖然都是15，但不同種的染色體組卻不相同。根據(jù)它們雜交是否親和，可以把甘薯近緣野生種植物分成兩大類群，即A群和B群[7]。A群品種有Ipomoea.lacunosa、Ipomoea.triloba、Ipomoea.gracilis等，B群品種有Ipomoea.leucantha、Ipomoea.littoralis、Ipomoea.batatas和Ipomoea.trifida及其系列種等。A群可以自交結(jié)實(shí)，相互雜交容易成功；B群能夠雜交，自交不結(jié)；A群與B群各種之間雜交并不親和。

I.trifida中文名為三淺裂野牽牛，有2倍體、3倍體、4倍體和6倍體[8]。I.trifida被認(rèn)為是甘薯的野生祖先[9-12]。I.trifida具有優(yōu)良的特性，如高淀粉、抗病蟲、耐病毒、抗旱等，可以通過利用甘薯栽培種與I.trifida群體進(jìn)行雜交，將其優(yōu)異性狀基因?qū)敫适碓耘喾N中，來提高甘薯品種的淀粉含量以及甘薯對(duì)病蟲害和環(huán)境的抗性。甘薯近緣種有不同倍數(shù)的染色體，但由于它們的細(xì)胞質(zhì)比較濃厚、染色體極小且數(shù)目多、著色能力又較弱、不易觀察，較難得到分裂相多、分散度高的制片[13]。目前對(duì)甘薯近緣野生種體細(xì)胞染色體形態(tài)、倍數(shù)分析等研究很少，相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究也相對(duì)薄弱，這對(duì)研究甘薯及近緣野生種的起源、分類以及進(jìn)化有著直接影響。因此，很有必要加強(qiáng)對(duì)甘薯野生種材料進(jìn)行染色體觀察和細(xì)胞學(xué)的研究鑒定。

秋水仙素是一種生物堿。自1937年美國學(xué)者布萊克斯利等用秋水仙素加倍曼陀羅等植物的染色體數(shù)獲得成功以后，秋水仙堿就被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的研究和植物育種中[14]；對(duì)二氯苯是一種有機(jī)化合物，用于有機(jī)合成，它是一種優(yōu)良的預(yù)處理藥物，在染色體制片技術(shù)中，基本上可以達(dá)到秋水仙素或其他藥物的效果[15]；8-羥基喹啉(8-HQ)是一種應(yīng)用范圍比較廣的殺菌劑，能夠與金屬離子結(jié)合，通過奪走細(xì)胞內(nèi)的銅離子和鐵離子起到抗菌作用，可用來對(duì)甘薯根尖細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理[16]。

在甘薯細(xì)胞染色體研究中，選擇合適的預(yù)處理劑、處理濃度及時(shí)間是獲得染色體分散均勻的中期分裂相的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用0.1%秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、2 mmol/L 8-HQ三種試劑對(duì)甘薯野生種I.trifida根尖進(jìn)行預(yù)處理，確定最佳預(yù)處理方法。采用最佳預(yù)處理方法明確秋水仙素加倍后的I.trifida和甘薯品種徐薯18的倍性，為其遠(yuǎn)緣雜交育種以及雜種細(xì)胞遺傳學(xué)行為的進(jìn)一步研究提供必要的細(xì)胞學(xué)依據(jù)，并為甘薯屬植物的染色體實(shí)驗(yàn)方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘薯近緣野生種I.trifida、甘薯品種徐薯18由徐州甘薯研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1根尖材料預(yù)處理與制片

剪取溫室盆栽I.trifida、秋水仙素處理加倍后的I.trifida、徐薯18枝條進(jìn)行水培，待其發(fā)根長(zhǎng)至1～1.5 cm，于08：00—10：00時(shí)取樣。將I.trifida根尖分別用0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ在4 ℃冰箱分別進(jìn)行1、2、3、4、5 h的預(yù)處理，用對(duì)二氯苯飽和溶液在室溫下分別進(jìn)行1、2、3、4、5 h的預(yù)處理，每種預(yù)處理液均設(shè)置清水處理的根尖作為對(duì)照。用卡諾氏溶液固定20～24 h，70%乙醇沖洗2次，轉(zhuǎn)入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取固定后的根尖材料，蒸餾水漂洗2～3次，于60 ℃恒溫水浴中用1 mol/L HCl解離8～10 min，用蒸餾水漂洗2～3次，蒸餾水中保存，0～1 h內(nèi)制片。切取尖端1～2 mm，搗碎，用改良苯酚品紅溶液染色5～10 min后，常規(guī)壓片鏡檢，將具有完整細(xì)胞輪廓，且染色體分散良好的細(xì)胞用SPOT RTKE冷CCD進(jìn)行采集圖像。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

在顯微鏡下觀察，選取細(xì)胞均勻分散的區(qū)域，統(tǒng)計(jì)有絲分裂指數(shù)。

有絲分裂指數(shù)=(視野內(nèi)觀察到的分裂細(xì)胞數(shù)目/視野內(nèi)觀察到的總細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.2.3染色體倍性分析

采用最佳預(yù)處理方法對(duì)秋水仙素加倍后的I.trifida與甘薯品種徐薯18進(jìn)行倍性鑒定。每種材料統(tǒng)計(jì)30個(gè)染色體分散良好的分裂相細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)具有一致染色體數(shù)目的細(xì)胞，把85%以上細(xì)胞都具有的染色體數(shù)目定為該植物的染色體數(shù)目[17]。

2 結(jié)果分析

2.1 不同預(yù)處理方法對(duì)壓片效果的影響

本試驗(yàn)中，使用0.1%秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、8-HQ三種試劑分別處理1、2、3、4、5 h的甘薯近緣野生種I.trifida根尖染色體壓片結(jié)果顯示，3種預(yù)處理劑均可以使根尖細(xì)胞的有絲分裂停留在中期。但采用對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ 溶液處理根尖后，染色體收縮程度適中，分散性良好，便于計(jì)數(shù)(見圖1)，而用秋水仙素處理的材料中染色體較長(zhǎng)，且分散性不理想。因此，在本試驗(yàn)中預(yù)處理劑選用對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ溶液較好。

注：A為對(duì)二氯苯飽和溶液處理3 h；B為2 mmol/L 8-HQ處理2 h。圖1 對(duì)二氯苯飽和溶液與2 mmol/L 8-HQ預(yù)處理的甘薯近緣種I. trifida根尖有絲分裂Fig.1 Root tip mitosis of I. trifida pretreated with saturated p-dichlorobenzene and 2 mmol/L 8-HQ

2.2 不同預(yù)處理方法對(duì)甘薯近緣種I.trifida根尖有絲分裂的影響

3種試劑在不同處理時(shí)間下對(duì)甘薯近緣種I.trifida根尖有絲分裂的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種預(yù)處理劑的對(duì)照組細(xì)胞中均有少許分裂相，但有絲分裂指數(shù)較低。隨著3種預(yù)處理劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)，有絲分裂指數(shù)均上升。其中0.1%秋水仙素處理 2 h 后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h 的1.18倍，是對(duì)照的2.68倍；對(duì)二氯苯飽和溶液處理3 h后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h的1.43倍，是對(duì)照的5.22倍；2 mmol/L 8-HQ處理2 h后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h的1.34倍，是對(duì)照的4.09倍。但隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，3種預(yù)處理劑的有絲分裂指數(shù)均有不同程度的下降趨勢(shì)，但均高于對(duì)照組。這說明不同預(yù)處理劑的處理時(shí)間很關(guān)鍵，更長(zhǎng)的預(yù)處理時(shí)間可能會(huì)部分抑制甘薯近緣野生種根尖細(xì)胞的有絲分裂。

表1 3種試劑不同處理時(shí)間對(duì)甘薯近緣野生種I.trifida根尖有絲分裂的影響

2.3 染色體倍性鑒定

用對(duì)二氯苯飽和溶液對(duì)甘薯近緣野生種I.trifida、秋水仙素加倍后的I.trifid與甘薯品種徐薯18的根尖進(jìn)行3 h預(yù)處理，采用相同的壓片方法進(jìn)行鏡檢。各材料染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)情況見表2，染色體形態(tài)見圖2。由表2可知，I.trifida染色體數(shù)為30的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的90%，秋水仙素加倍的I.trifid染色體計(jì)數(shù)為60的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86.7%，徐薯18染色體計(jì)數(shù)為90的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯近緣種I.trifida染色體數(shù)目以30條為主，秋水仙素加倍處理后的I.trifid染色體數(shù)目以60條為主，徐薯18染色體數(shù)目以90條為主。由于甘薯屬植物染色體基數(shù) x=15，因此本實(shí)驗(yàn)中甘薯近緣種I.trifida是二倍體(2 n=2 x=30)，秋水仙素加倍處理后的I.trifid是四倍體(2 n=4 x=60)，徐薯18是六倍體(2 n=6 x=90)。

表2 各材料不同數(shù)目染色體的細(xì)胞及比例

注：A為I.trifida；B為秋水仙素加倍后的I.trifid；C為徐薯18。圖2 染色體倍性計(jì)數(shù)Fig.2 Chromosome number of the materials

3 討 論

由于甘薯近緣種染色體比較小且數(shù)目多、著色能力弱、不易觀察[13,16]，所以在對(duì)其進(jìn)行染色體觀察以及計(jì)數(shù)時(shí)，最好是在細(xì)胞分裂下進(jìn)行，以有絲分裂中期的染色體最為合適。在細(xì)胞學(xué)上常利用秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、8-HQ對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理來積累中期分裂細(xì)胞，便于染色體觀察。每種植物的染色體大小及數(shù)目不同，所采用的預(yù)處理劑的濃度、時(shí)間及其效果也不同。有關(guān)預(yù)處理劑對(duì)不同材料進(jìn)行根尖細(xì)胞有絲分裂的研究，在花生、辣椒、大蒜、洋蔥、蠶豆等[18-22]植物中均有報(bào)道，而相關(guān)研究在甘薯屬植物中報(bào)道較少。本研究比較不同的預(yù)處理方法對(duì)甘薯近緣種I.trifida積累中期分裂相的影響，得出最優(yōu)的預(yù)處理方法，從而為甘薯近緣野生種及其他甘薯根尖細(xì)胞預(yù)處理提供了直接參考，達(dá)到減少實(shí)驗(yàn)步驟和避免材料浪費(fèi)的目的。

本試驗(yàn)中，對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ溶液壓片效果較好，對(duì)二氯苯飽和溶液處理I.trifida根尖3 h時(shí)，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)最高。其中2 mmol/L 8-HQ處理2 h時(shí)甘薯近緣野生種I.trifida細(xì)胞有絲分裂指數(shù)最高，這與王路等[16]研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ和對(duì)二氯苯飽和水溶液3種預(yù)處理劑均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，I.trifida根尖有絲分裂指數(shù)均先增加后降低(見表1)，這與賽爾蘭·熱合買提等[23]研究結(jié)果相同。其原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的處理影響細(xì)胞內(nèi)原有的代謝活力，改變了細(xì)胞內(nèi)原有的物質(zhì)平衡并阻止細(xì)胞內(nèi)的分裂轉(zhuǎn)化，相應(yīng)延長(zhǎng)了細(xì)胞周期，導(dǎo)致根尖生長(zhǎng)緩慢[23-24]。本試驗(yàn)沒有對(duì)不同預(yù)處理劑進(jìn)行更小范圍的處理時(shí)間研究，更小范圍的處理時(shí)間對(duì)I.trifida細(xì)胞的有絲分裂的影響是否顯著，還需進(jìn)一步研究探討。

I.trifida被公認(rèn)為甘薯的近緣祖先，但I(xiàn).trifida在分類學(xué)和甘薯進(jìn)化中的地位還存在很大爭(zhēng)議，因?yàn)樵撈贩N存在二倍體、四倍體和六倍體。因此有研究者認(rèn)為，I.trifida本身就是一個(gè)包括從二倍體到六倍體的多倍體和多倍體間雜種的綜合群體——復(fù)合體(species，complex)[9,25]。迄今為止，甘薯近緣種I.trifida只有六倍體成功應(yīng)用于甘薯育種中。經(jīng)本試驗(yàn)中最優(yōu)處理方法鑒定供試材料甘薯近緣種I.trifida為二倍體。六倍體甘薯自交不親和，由于雜交育種，導(dǎo)致甘薯遺傳背景非常復(fù)雜。與六倍體甘薯相比，二倍體I.trifida遺傳組成簡(jiǎn)單，遺傳背景清晰。將遺傳背景清晰的甘薯近緣種I.trifida作為親本，和我國栽培甘薯品種進(jìn)行雜交，既能將甘薯野生種質(zhì)導(dǎo)入栽培甘薯品種中，又可以降低甘薯野生種質(zhì)遺傳干擾，從而能更加集中目標(biāo)進(jìn)行甘薯遺傳研究。本試驗(yàn)中經(jīng)秋水仙素處理加倍后的I.trifida經(jīng)鑒定是四倍體。多倍體可以在遠(yuǎn)緣雜交中克服種間不育性，實(shí)現(xiàn)基因的種間轉(zhuǎn)移[26]，具有更強(qiáng)的遺傳可塑性[27]。對(duì)于得到的四倍體I.trifida是否能夠直接利用，或作為中間親本把其野生親本的優(yōu)良性狀傳遞到栽培種中，還有待于進(jìn)一步研究。

甘薯是一種遺傳上很復(fù)雜、很不穩(wěn)定并且十分難掌握的試驗(yàn)材料，雖然它的野生資源的種類十分豐富而且分布廣泛，但人們所能收集到的甘薯野生資源還很少，所以關(guān)于甘薯屬植物種的分類原則、進(jìn)化關(guān)系在世界上至今仍然沒有得到統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。有關(guān)甘薯屬植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究在我國仍然比較薄弱，而且國外有關(guān)這方面的文獻(xiàn)也比較少。但隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展、甘薯育種要求越來越高以及野生資源的進(jìn)一步引進(jìn)、開發(fā)和利用，這些問題會(huì)變得越來越清楚。