賈 娜， 王曉紅， 李 林， 于曉松， 劉 智， 張明生

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室， 貴陽 550025)

鉤藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq. ex Havil.)為茜草科(Rubiaceae)鉤藤屬(Uncaria)植物，常以干燥帶鉤莖枝入藥[1]，具有息風(fēng)定驚，清熱平肝之功效。鉤藤在我國分布較廣，主要生長于貴州、廣西等省區(qū)，野生資源較為豐富。鉤藤中的有效成分主要有生物堿類、黃酮類、有機酸類和甙類化合物，其中以生物堿含量最為豐富且為發(fā)揮藥理作用的主要成分[2]。生物堿有效成分為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等，其中鉤藤堿及異鉤藤堿已被證明具有顯著的降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜和治療老年癡呆癥等功效，同時對治療風(fēng)熱頭痛、頭暈?zāi)垦５劝Y具有較好的效果且副作用小[3-6]。此外，鉤藤中的三萜酯類和鉤藤酸類對結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[7]，因此，鉤藤在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)潛力。

木本植物育種周期普遍較長且雜合度較高，導(dǎo)致其育種相關(guān)研究較其他植物進展緩慢，而隨著植物組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)的發(fā)展，通過建立穩(wěn)定高效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系來進行基因功能驗證及性狀改良的研究在木本植物中逐漸增多[8-10]，極大優(yōu)化并加快了木本植物的育種研究進程。植物遺傳轉(zhuǎn)化有多種技術(shù)，其中由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化因具有操作簡單、成本較低、周期較短及所得遺傳轉(zhuǎn)化植株可育等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[11]。遺傳轉(zhuǎn)化體系成功構(gòu)建的前提是具有穩(wěn)定高效的組培再生體系，關(guān)于鉤藤再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，起初毛堂芬等[12]對基本培養(yǎng)基進行過探索，之后施力軍等[13]以鉤藤莖段為外植體探究了鉤藤的分化階段；在此基礎(chǔ)上，吳順等[14]以鉤藤莖段，葉片及葉柄為外植體對愈傷誘導(dǎo)進行研究，初步建立了鉤藤的再生體系。對于鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，僅吳順等[15]以鉤藤的葉片、莖段及葉柄為外植體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌對其進行浸染,探討了不同鉤藤外植體、菌液濃度、AS濃度、干燥處理時間對毛狀根誘導(dǎo)率的影響。

本實驗以鉤藤種子無菌萌發(fā)的植株葉片為外植體，探究不同因素對鉤藤組培再生體系中各階段的影響，優(yōu)化建立了穩(wěn)定高效的鉤藤組培再生體系，以鉤藤再生體系為基礎(chǔ)，采用葉盤法探究鉤藤無菌離體葉片對卡那霉素的抗壓程度，預(yù)培養(yǎng)時間、浸染液中AS濃度、菌液濃度、浸染時間及共培養(yǎng)時間對鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，經(jīng)過抗性篩選獲得陽性植株，以野生型鉤藤植株作為對照，通過PCR檢測鑒定GUS基因順利轉(zhuǎn)入。本研究成功建立鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系，為鉤藤功能基因研究與定向改良奠定基礎(chǔ)，對鉤藤資源的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

鉤藤種子采自貴州省黔東南州鉤藤種植基地(26°27′55″N，106°39′21″E)。實驗采用的農(nóng)桿菌菌株為EHA 105，質(zhì)粒PBI 121，該質(zhì)粒含有GUS報告基因及卡那霉素抗性基因，菌株及載體保存于貴州大學(xué)生理生化與分子生物學(xué)實驗室，試驗時間2018年9月—2020年8月。

1.2 方 法

1.2.1種子消毒

將種子在流水下沖洗2 h后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上，用75%酒精消毒15 s后用無菌水清洗3次，再使用10%次氯酸鈉消毒8 min，無菌水清洗4～5次，接種于提前準(zhǔn)備好的平板中，種子與培養(yǎng)基間用濾紙間隔進行萌發(fā)獲得鉤藤的無菌苗。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)

將鉤藤葉片切割成約0.5 cm2大小，以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖(10、2、30 g/L)、2,4-D(2.0、3.0、4.0 mg/L)、6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.5、1.0、1.5 mg/L)進行四因素三水平正交實驗，2周后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率，篩選愈傷誘導(dǎo)適宜條件。以WPM、MS和B 5為基本培養(yǎng)基，添加優(yōu)化后的激素組合探究誘導(dǎo)鉤藤愈傷組織適宜的基本培養(yǎng)基，再將接種好的材料分成兩組，一組置于光照強度為31～35 μmol/(m2·s)、光照時間14 h/d、培養(yǎng)溫度(25±2)℃的條件下，另一組置于同溫度條件下遮光培養(yǎng)，探究遮光對鉤藤愈傷誘導(dǎo)的影響。每個處理20瓶，每瓶接種5片，3次重復(fù)。

愈傷誘導(dǎo)率(%)=(出愈葉片數(shù)/接種的葉片數(shù))×100%。

1.2.3不定芽的誘導(dǎo)

將鉤藤愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以WPM、MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基并添加6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)進行三因素三水平正交實驗，30 d后統(tǒng)計不定芽的誘導(dǎo)率。每個處理20瓶，每瓶接種4塊愈傷組織，3次重復(fù)。

不定芽誘導(dǎo)率(%)=(出芽個數(shù)/接種的愈傷塊數(shù))×100%。

1.2.4葉片對卡那霉素的抗壓篩選

取鉤藤無菌苗葉片接種于含有不同濃度的卡那霉素(0，30，50，70，90 mg/L)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率及葉片存活情況，將愈傷組織繼續(xù)接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計不定芽的發(fā)生率，獲得適宜的卡那霉素篩選濃度。

1.2.5預(yù)培養(yǎng)時間篩選

以優(yōu)化所得的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為預(yù)培養(yǎng)基，葉片裁剪為0.5 cm2大小，接種時葉片背面接觸培養(yǎng)基進行預(yù)培養(yǎng)，時間設(shè)置0、2、4 d，將經(jīng)過不同時間預(yù)培養(yǎng)的葉片在OD600=0.6的浸染液中浸染10 min[10]，用濾紙吸干葉片表面菌液，共培養(yǎng)2 d，結(jié)束共培養(yǎng)后進行GUS染色并統(tǒng)計GUS染色的陽性率以獲得最適預(yù)培養(yǎng)時間。

GUS染色的陽性率(%)=(著色葉片數(shù)/染色總數(shù))×100%。

1.2.6浸染液中AS濃度篩選

取OD600=0.6時的農(nóng)桿菌菌液，4 000 r/min離心10 min去上清，用WPM液體培養(yǎng)基重懸菌體配置成浸染液對進行外植體浸染，浸染時間為10 min[10]，共培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)基中AS濃度設(shè)置為0、30、60、90、120 mg/L，將共培養(yǎng)后的葉片進行GUS染色，以獲得共培養(yǎng)基中適宜的AS濃度。

1.2.7浸染濃度、浸染時間及共培養(yǎng)時間正交實驗

取鉤藤無菌苗葉片裁剪為0.5 cm2大小，設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時間為0 d，浸染液中添加120 mg/L AS，以O(shè)D600(0.4、0.6、0.8)、農(nóng)桿菌浸染時間(5、10、15 min)以及共培養(yǎng)時間(2、3、4 d)設(shè)置L9(34)正交實驗。將共培養(yǎng)結(jié)束的鉤藤葉片進行GUS染色，再經(jīng)酒精脫色后統(tǒng)計GUS染色陽性率，獲得正交試驗最優(yōu)組合。每個處理20皿，每皿放置8個葉片，3次重復(fù)。

1.2.8陽性植株的獲得及PCR檢測

通過上述實驗所獲得遺傳轉(zhuǎn)化最優(yōu)條件，對鉤藤葉片采用葉盤法進行遺傳轉(zhuǎn)化操作后，接種在含有50 mg/L卡那霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選抗性葉片，將篩選獲得的葉片轉(zhuǎn)接至組培再生體系來獲得抗性幼苗，利用RNA試劑盒提取抗性幼苗葉片中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GUS基因特異性引物(F-GUS：TACCGACGAAAACGGCAAGA；R-GUS：CAACTCCTACCGTACCTCGC)進行PCR檢測，PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，將野生型鉤藤幼苗cDNA作為對照，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用DPS及Minitab 18統(tǒng)計分析軟件進行顯著性(p<0.05)分析，使用Origin 2018軟件進行繪圖。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母之間表示在(p<0.05)水平上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤藤組培再生體系的優(yōu)化

2.1.1不同因素對鉤藤愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1 不同影響因素對鉤藤愈傷誘導(dǎo)率的影響Table 1 The influence of different factors on callus induction of Uncaria rhynchophylla

基本培養(yǎng)基及光照對愈傷組織的形成均有一定的影響。由圖1 A可見，當(dāng)使用WPM作為鉤藤愈傷誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基時，誘導(dǎo)效果最好且褐化率較低，其次是MS培養(yǎng)基，但通過顯著性分析可知二者并無顯著性差異，而B 5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最差，與前兩者相比愈傷誘導(dǎo)率顯著降低，同時褐化率較高。對外植體遮光處理后愈傷誘導(dǎo)率顯著增高且褐化率顯著降低，相對于光照條件，其出愈時間縮短(圖1 B)。

注：A為基本培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響， B為遮光處理對愈傷誘導(dǎo)的影響。圖1 基本培養(yǎng)基及遮光處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.1 The effect of basic medium and shading treatment on callus induction

注：A為種子萌發(fā)；B為以WPM為基本培養(yǎng)基所得愈傷組織；C為遮光處理所得愈傷組織；D為愈傷分化產(chǎn)生不定芽。圖2 鉤藤組培再生過程Fig.2 Tissue culture regeneration of Uncaria rhynchophylla

2.1.2基本培養(yǎng)基及激素水平對鉤藤不定芽誘導(dǎo)的影響

基本培養(yǎng)基可以為植物提供其生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，不同植物所需的營養(yǎng)種類及所需含量不一樣，外源激素對誘導(dǎo)不定芽發(fā)生也起關(guān)鍵作用。由表2中極差分析得出，基本培養(yǎng)基相較外源激素對誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的影響最大，其次是NAA的濃度，6-BA的影響最小，且WPM最適合進行鉤藤的不定芽誘導(dǎo)，MS培養(yǎng)基的出芽效果最差。鉤藤不定芽的分化率會隨著6-BA濃度的增加而增加，但當(dāng)6-BA持續(xù)增長時，其出芽率也會有明顯降低的趨勢，低濃度的NAA對誘導(dǎo)鉤藤不定芽的發(fā)生有較好的效果，同時6-BA與NAA濃度的比值不斷增加時其出芽率會逐漸增高。通過顯著性分析，處理2的出芽率最高，為87.6%。

本實驗成功優(yōu)化并建立了高效的鉤藤組培再生體系，依次獲得種子萌發(fā)的鉤藤無菌幼苗、愈傷組織及不定芽(圖2)。

表2 不同影響因素對鉤藤不定芽誘導(dǎo)的交互作用Table 2 Interaction of different influencing factors on adventitious bud induction of Uncaria rhynchophylla

2.2 鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.2.1鉤藤葉片對卡那霉素的敏感性

由表3得知，不添加卡那霉素時鉤藤葉片可正常誘導(dǎo)愈傷組織進而誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，當(dāng)卡那霉素濃度為30 mg/L時，抗生素已經(jīng)明顯抑制愈傷組織的發(fā)生，鉤藤葉片出現(xiàn)死亡，此時愈傷誘導(dǎo)率為48.89%，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上時，不定芽誘導(dǎo)率隨之降低；卡那霉素的濃度增加至50 mg/L時，鉤藤葉片愈傷誘導(dǎo)率急劇下降，僅有7.49%，此時葉片大量死亡，不定芽的誘導(dǎo)率也極低；卡那霉素增長至70 mg/L時，鉤藤葉片的愈傷誘導(dǎo)被完全抑制，不定芽也未成功誘導(dǎo)。綜上，根據(jù)半致死劑量原則，確定篩選培養(yǎng)基中適宜的卡那霉素濃度為30 mg/L。

表3 鉤藤葉片對卡那霉素的敏感性Table 3 Sensitivity of Uncaria rhynchophylla leaves to Kanamycin

注：A為不同預(yù)培養(yǎng)時間下GUS染色陽性率；B為共培養(yǎng)基中添加不同濃度AS時GUS染色陽性率。圖3 預(yù)培養(yǎng)時間及共培養(yǎng)基中AS濃度對鉤藤葉片遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 The effect of pre-cultivation time and AS concentration in the co-culture medium on the genetic transformation efficiency of Uncaria rhynchophylla leaves

2.2.2預(yù)培養(yǎng)時間及AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

通過GUS染色陽性率顯示，不同的預(yù)培養(yǎng)時間及共培養(yǎng)基中AS濃度對鉤藤葉片遺傳轉(zhuǎn)化效率具有顯著性的影響。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間不斷增加，GUS染色的陽性率先增加后降低，不進行預(yù)培養(yǎng)操作時GUS染色陽性率依舊較高，預(yù)培養(yǎng)時間為2 d時，GUS染色陽性率明顯升高，預(yù)培養(yǎng)時間增至4 d時，GUS染色陽性率最低(圖3-A)。同時GUS染色陽性率會隨著共培養(yǎng)基中AS濃度的增加不斷增高(圖3-B)，當(dāng)浸染液中不添加AS時，雖有一定的GUS染色陽性率，但較低，當(dāng)AS的濃度不斷增加時GUS染色陽性率逐漸增加，AS濃度為120 μmol/L時，GUS染色陽性率達到最高。因此，利用鉤藤葉片進行遺傳轉(zhuǎn)化時，共培養(yǎng)基中AS的適宜濃度為120 μmol/L。

[80] [美]帕特里克·克羅寧：《南海地區(qū)的權(quán)力與秩序：美國南海政策的戰(zhàn)略框架》，《亞太安全與海洋研究》2017年第1期，第36頁。

2.2.3不同因素對轉(zhuǎn)化效率的交互影響

對正交實驗結(jié)果(表4)進行極差分析可知，菌液濃度對GUS染色陽性率的影響最大，極差為37.94，其次為農(nóng)桿菌的浸染時間，而共培養(yǎng)時間對其影響最小。在農(nóng)桿菌浸染時間及共培養(yǎng)時間固定時，GUS染色陽性率隨菌液濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。在OD600=0.8時鉤藤葉片中GUS染色陽性率較其他濃度顯著提高，在OD600=0.4時，不斷增加浸染時間及共培養(yǎng)時間，GUS染色陽性率依舊較低。浸染時間為10 min時，GUS染色陽性率比在其他時間處理下顯著提高。此外，當(dāng)OD600為0.4～0.6同時隨著浸染時間的增加，共培養(yǎng)時間逐漸增加時，GUS染色陽性率呈先增加后降低的趨勢即在共培養(yǎng)時間為3 d時，轉(zhuǎn)化效率較高。但當(dāng)OD600=0.8，共培養(yǎng)時間為2 d的條件下，GUS染色陽性率顯著高于其他同菌液濃度下的處理。通過對不同處理下的葉片進行GUS染色如圖4，編號8的染色效果較其他處理效果較好，著色強度較大，而編號1的效果最差，著色強度極小。綜上OD600=0.8，農(nóng)桿菌浸染時間10 min,共培養(yǎng)時間2 d的條件下轉(zhuǎn)化率最高，為60.06%。

注：1～9為正交表相應(yīng)編號處理下GUS染色效果；10為野生型鉤藤葉片GUS染色效果(10×40)。圖4 正交實驗GUS染色效果Fig.4 Effect of GUS dyeing by orthogonal experiment

注：M為DL 2 000 Marker；PC為陽性對照(PBI 121質(zhì)粒)；NC為陰性對照(野生型鉤藤幼苗)；1～7為轉(zhuǎn)化所得陽性植株反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果。圖5 轉(zhuǎn)化所得鉤藤陽性植株GUS基因PCR擴增電泳檢測圖譜Fig.5 The GUS gene PCR amplification and electrophoresis detection pattern of the transformed U. rhynchophylla positive plants

表4 菌液濃度、浸染時間及共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化率的影響Table 4 The influence of bacterial solution concentration, dip time and co-cultivation time on genetic transformation rate

2.3 抗性幼苗的陽性檢測

取鉤藤葉片結(jié)合實驗所得最優(yōu)條件組合進行遺傳轉(zhuǎn)化操作后，接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基加入50 mg/L卡那霉素進行篩選后，轉(zhuǎn)接至優(yōu)化所得再生體系中培養(yǎng)抗性鉤藤幼苗，將獲得的抗性植株切取一部分進行GUS染色進行初步篩選，以檢測抗性幼苗是否為轉(zhuǎn)基因陽性幼苗。再以野生型鉤藤幼苗為對照，將檢測到的7株陽性轉(zhuǎn)基因幼苗提取葉片中的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行PCR檢測，經(jīng)1%凝膠電泳，結(jié)果見圖4，通過抗性篩選獲得的7株陽性幼苗均擴增出相應(yīng)條帶。

3 討 論

3.1 鉤藤組培再生體系的優(yōu)化

糖原在培養(yǎng)基中除提供能源外還可調(diào)節(jié)滲透壓，而植物在進行脫分化形成愈傷組織的過程中能源必不可少[16-17]。WPM培養(yǎng)基因其本身具有較低的無機鹽含量，更加適應(yīng)鉤藤等木本植物的生長。植物學(xué)研究表明，外植體可在暗培養(yǎng)下進行脫分化形成愈傷組織，因此將鉤藤葉片進行遮光培養(yǎng)時愈傷組織誘導(dǎo)率顯著增加。

對大部分的木本植物來說，欲使愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽，通常需要一定外源激素的作用；同時很多木本植物在進行愈傷誘導(dǎo)時僅添加6-BA和NAA而不添加2,4-D[18]，但結(jié)果顯示，2,4-D對鉤藤愈傷誘導(dǎo)有顯著影響；當(dāng)不斷增加6-BA及NAA的濃度時，鉤藤不定芽的分化反而降低，這可能和植物種類、生長條件及組織部位等的不同，不同激素的內(nèi)生水平也不相同，因而對不定芽發(fā)生過程來說，它們所要求的外源激素的水平也會有所不同[19-20]。實驗所得愈傷誘導(dǎo)率最高可達96.32%，同時補充遮光及不同培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響；不定芽的誘導(dǎo)率為87.6%，較吳順等[14]研究的愈傷誘導(dǎo)率(83.3%)提高13.02%，不定芽發(fā)生率(82.3%)提高5.3%，成功優(yōu)化建立了高效的鉤藤組培再生體系。

3.2 鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

篩選培養(yǎng)基添加卡那霉素旨在有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長并使其死亡，同時又要求所添加的濃度不能影響成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長[21-22]，因此在篩選培養(yǎng)基中所添加的卡那霉素濃度很關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，T-DNA的轉(zhuǎn)移、整合是在共培養(yǎng)階段進行，所以需外植體在共培養(yǎng)時達到最佳的分裂狀態(tài)，而不同植物在轉(zhuǎn)化前進行預(yù)培養(yǎng)所獲得的效果有所不同，有些植物因脫分化較易且快而不用進行預(yù)培養(yǎng)，但很多木本植物其自身脫分化較慢就需要進行預(yù)培養(yǎng)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤雖為木本植物，但其外植體不進行預(yù)培養(yǎng)時遺傳轉(zhuǎn)化效率反而較高，推測可能與其自身愈傷組織誘導(dǎo)較易及自身特殊性有關(guān)。

在遺傳轉(zhuǎn)化操作中，菌液濃度過低時浸染效率不高，濃度過高又會產(chǎn)生毒害作用導(dǎo)致外植體的褐化死亡[26-27]；農(nóng)桿菌是通過傷口進入植物組織，根癌農(nóng)桿菌攜帶的目的基因，在共培養(yǎng)階段經(jīng)過加工后，向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移,進而整合到植物基因組中，因此浸泡時間過短不能使足夠量的農(nóng)桿菌附著于傷口處，從而降低了轉(zhuǎn)化效率，浸泡時間過長又會導(dǎo)致外植體的褐化死亡，同時導(dǎo)致后續(xù)除菌困難[28-29]；共培養(yǎng)時間的長短，對目的基因的整合及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量也有著很大的影響[30]，對鉤藤而言，浸染后隨著共培養(yǎng)時間的延長，其轉(zhuǎn)化效率反而降低，隨著菌液濃度增加，遺傳轉(zhuǎn)化效率顯著增加，表明較高的菌液濃度適宜其進行遺傳轉(zhuǎn)化，這可能是木本植物其自身的木質(zhì)部發(fā)達質(zhì)地堅硬的原因，也可能是不同種類鉤藤特性及取材時幼苗的生長狀態(tài)不同，具體原因有待下一步對比探究。

4 結(jié) 論

綜上所述，鉤藤愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+3 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖同時遮光培養(yǎng)；最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；葉片對卡那霉素抗壓篩選條件為30 mg/L；最適遺傳轉(zhuǎn)化因子組合為：預(yù)培養(yǎng)2 d，OD600=0.8，共培養(yǎng)基中加入120 μmol/L AS，浸染時間10 min，共培養(yǎng)時間2 d。經(jīng)PCR檢測證明，GUS基因可順利轉(zhuǎn)入鉤藤基因組中并作為其遺傳轉(zhuǎn)化的指示基因。表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系可以構(gòu)建，并能成功得到具有相關(guān)抗性的植株，為鉤藤后續(xù)基因功能的驗證及品種改良奠定基礎(chǔ)。