張 娜

（蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

1 影響機(jī)理

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物不僅是物質(zhì)循環(huán)調(diào)節(jié)者，而且是有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分的一部分，能參與養(yǎng)料轉(zhuǎn)化、有機(jī)碳代謝等多種過(guò)程。在微生物作用下，有機(jī)質(zhì)將被分解為簡(jiǎn)單的化合物，釋放出礦質(zhì)養(yǎng)料和能量。對(duì)于土壤微生物來(lái)講，有機(jī)質(zhì)能為其活動(dòng)提供養(yǎng)分和能量，因此，土壤中有機(jī)質(zhì)含量越高，微生物種群、數(shù)量越多。而微生物功能群指的是擁有相同功能但不同形態(tài)的微生物，在功能群存在差異的情況下，轉(zhuǎn)化的有機(jī)質(zhì)不同。因此，微生物功能群數(shù)量能反映土壤各因素給微生物區(qū)系帶來(lái)的影響。

從土壤環(huán)境給微生物區(qū)系帶來(lái)的影響來(lái)看，環(huán)境條件的變化將給微生物生長(zhǎng)、繁殖等各方面帶來(lái)影響?？紤]到微生物受到多種環(huán)境因子的影響，應(yīng)進(jìn)一步把握不同因子對(duì)微生物的影響規(guī)律，以便通過(guò)改善環(huán)境促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)。從現(xiàn)有研究來(lái)看，溫濕度、有機(jī)質(zhì)含量、酸堿度等因子都會(huì)對(duì)微生物造成影響。例如，環(huán)境濕度增加有助于微生物繁殖，但濕度過(guò)大會(huì)抑制微生物繁殖，所以濕度波動(dòng)會(huì)引起土壤微生物群落變化；有機(jī)質(zhì)含量則用于衡量土壤肥力，其含量與微生物群落大小密切相關(guān)，如土壤含有豐富腐殖質(zhì)時(shí)將產(chǎn)生大量細(xì)菌；土壤酸堿度直接影響微生物代謝活動(dòng)，超出微生物適生范圍將引發(fā)微生物死亡。因此，可對(duì)3種因子改變后土壤微生物數(shù)量變化情況展開(kāi)研究，進(jìn)一步把握土壤環(huán)境條件與微生物區(qū)系之間的關(guān)系。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

供試土壤為黑鈣土。采用全球定位系統(tǒng)精準(zhǔn)定位采樣位置，共完成3次采樣，各次采樣時(shí)間點(diǎn)（15:00—17:00）保持一致。使用五點(diǎn)法采樣，在選定采樣點(diǎn)劃四邊形，在4個(gè)頂點(diǎn)和兩條對(duì)角線交點(diǎn)采樣，各點(diǎn)采樣深度0～20 cm。用直徑16 cm、高10 cm的玻璃容器盛裝采集的土壤樣品。正式開(kāi)展試驗(yàn)前，對(duì)采集后的土壤理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，反映真實(shí)的采樣環(huán)境。取部分新鮮土樣將大石礫、動(dòng)植物殘?bào)w等去除，采用烘干法測(cè)定土樣含水量，并利用硫酸-重鉻酸鉀滴定法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量。供試土壤的基本理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)含量16.61 g/kg，全氮含量0.8 g/kg，全磷含量0.65 g/kg，堿解氮含量97.4 mg/kg，有效磷含量64.11 mg/kg，pH值6.67，容重1.51 g/cm。土壤微生物菌群主要由細(xì)菌、真菌、放線菌組成。

2.2 試驗(yàn)方法

分別稱取3 kg新鮮土壤樣本裝入10個(gè)玻璃容器中，編號(hào)為0～9。其中，0為對(duì)照組，不做任何處理，直接進(jìn)行不同微生物功能群分類測(cè)定。1～9為試驗(yàn)組，按照不同條件處理，完成正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示。處理5 d后測(cè)定各試驗(yàn)組的微生物數(shù)量。完成正交試驗(yàn)后，考慮到有機(jī)質(zhì)礦化等過(guò)程需要一定時(shí)間，不同時(shí)段各環(huán)境因子對(duì)微生物區(qū)系產(chǎn)生的影響程度可能發(fā)生變化，需要采用極差分析法分別在第5天、第40天、第130天分析土壤菌群的變化特征，確認(rèn)不同時(shí)段對(duì)微生物區(qū)系產(chǎn)生主要影響的環(huán)境因子，進(jìn)一步掌握土壤中微生物數(shù)量變化規(guī)律。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3 測(cè)定方法

對(duì)微生物功能群落進(jìn)行分類，使用梯度稀釋法完成土樣懸液制備。稱取10 g土樣放入裝有90 mL無(wú)菌水和少量玻璃珠的三角瓶，經(jīng)過(guò)20 min振蕩確認(rèn)充分混合，使用1 mL吸管取懸液添加至裝有9 mL無(wú)菌水的試管中。均勻混合后，得到土樣10稀釋液，靜置2 min后稀釋成不同稀釋度的土樣懸液?；凇妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）標(biāo)準(zhǔn)，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)?；谖⑸锲桨迮囵B(yǎng)方法，選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基分別在28～30 ℃溫度條件下培養(yǎng)兩三天，對(duì)分離獲得的細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)。同時(shí)，選用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基在35 ℃溫度環(huán)境下培養(yǎng)3～5 d，對(duì)分離獲得的放線菌計(jì)數(shù)。在操作過(guò)程中，使用標(biāo)簽在不同培養(yǎng)皿蓋上標(biāo)注培養(yǎng)基名稱、懸液稀釋度等信息，各梯度應(yīng)標(biāo)記3～5皿。使用吸管將0.2 mL稀釋液滴入平板中央，使用無(wú)菌玻璃涂棒沿著培養(yǎng)基表面以直線方式均勻涂布，在室溫下靜置5～10 min后進(jìn)行倒置培養(yǎng)。利用稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法計(jì)量微生物數(shù)量，稀釋至新鮮培養(yǎng)基中無(wú)菌斑生長(zhǎng)，可以對(duì)之前3個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿中微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)最大或然數(shù)表完成近似值查找，乘以數(shù)量指標(biāo)首位數(shù)的稀釋倍數(shù)確定菌液含菌數(shù)量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用相關(guān)系數(shù)法，用Excel軟件進(jìn)行圖表處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同環(huán)境因子給微生物數(shù)量帶來(lái)的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）可知，對(duì)細(xì)菌數(shù)影響最大的因素為水分，其次為有機(jī)質(zhì)，溫度產(chǎn)生的影響較小。因?yàn)橥寥篮窟_(dá)到100%的條件下，細(xì)菌數(shù)量最多，同時(shí)細(xì)菌數(shù)量隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量的增加而增加。對(duì)真菌來(lái)講，水分產(chǎn)生的影響較小，溫度產(chǎn)生的影響較大，在8 ℃條件下真菌數(shù)量較多，之后真菌數(shù)量隨著溫度的升高而呈現(xiàn)出先減少后增加趨勢(shì)。有機(jī)質(zhì)對(duì)真菌數(shù)量的影響無(wú)明顯規(guī)律。從放線菌數(shù)量變化來(lái)看，溫度為主要的影響因素。隨著溫度的增加，放線菌數(shù)量逐步減少。有機(jī)質(zhì)也是影響放線菌數(shù)量的重要因素，因?yàn)殡S著有機(jī)質(zhì)含量的增加，放線菌數(shù)量有所減少。水分對(duì)放線菌數(shù)量產(chǎn)生的影響不明顯。從總體分析結(jié)果來(lái)看，細(xì)菌數(shù)量變化主要受水分因素影響，真菌和放線菌數(shù)量主要受溫度因素影響，而有機(jī)質(zhì)含量會(huì)對(duì)細(xì)菌和放線菌數(shù)量帶來(lái)一定影響。相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組細(xì)菌和放線菌數(shù)都明顯增加。分析原因可知，與各組有機(jī)質(zhì)含量增加密切相關(guān)。土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)的主要推動(dòng)者，將直接參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化過(guò)程，對(duì)于土壤質(zhì)量、肥力效果具有重要影響。有機(jī)質(zhì)作為土壤中各種動(dòng)植物殘?bào)w分解與合成產(chǎn)物的總稱，其含量增加意味著含碳有機(jī)物含量增加，能夠給細(xì)菌數(shù)量、活力帶來(lái)明顯影響。在自然環(huán)境中土壤表面存在覆蓋物，對(duì)土壤溫濕度、水分、肥力變化起到一定影響。經(jīng)由施肥進(jìn)行土壤理化性質(zhì)改良后，隨著土壤中有機(jī)質(zhì)含量的增加，細(xì)菌、放線菌數(shù)量呈同步增長(zhǎng)趨勢(shì)，真菌數(shù)量變化則主要受到其他因素的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果 個(gè)/g

3.2 各時(shí)段不同環(huán)境因子的影響程度

現(xiàn)有研究成果表明，土壤溫度、濕度、成分類型等因素將共同作用于微生物呼吸，進(jìn)而影響碳循環(huán)。通過(guò)施加肥料補(bǔ)充土壤養(yǎng)分、增加有機(jī)質(zhì)含量后，可使細(xì)菌、真菌數(shù)量發(fā)生顯著變化。在獲取不同環(huán)境因子對(duì)于微生物存活數(shù)量產(chǎn)生影響的試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用極差分析方法進(jìn)行不同因子作用關(guān)系的判斷，如表3所示。開(kāi)展長(zhǎng)達(dá)130 d的試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)較多，無(wú)法一一羅列。為簡(jiǎn)化分析過(guò)程，采用極差分析法對(duì)相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，在其他環(huán)境因子不變的條件下，對(duì)單一因子引發(fā)細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量變化情況展開(kāi)分析，將單一微生物功能群數(shù)量最大值減去最小值可以得到極差。因此，根據(jù)極差大小能確定微生物數(shù)量變化幅度，確定對(duì)微生物數(shù)量影響最大的環(huán)境因子。

表3 不同環(huán)境因子與微生物菌群數(shù)量的極差分析 個(gè)/g

試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為5 d時(shí)，水分因子變化導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量極差達(dá)到9.44×10個(gè)/g，明顯超過(guò)有機(jī)質(zhì)和溫度因子變化產(chǎn)生的細(xì)菌極差值，因此，水分因子是影響細(xì)菌數(shù)量的最主要指標(biāo)。在水分含量為100%、有機(jī)質(zhì)含量較高的情況下，可使土壤中細(xì)菌數(shù)量明顯增加。溫度因子是影響真菌數(shù)量的關(guān)鍵指標(biāo)，真菌數(shù)量在低溫條件下達(dá)到峰值，整體來(lái)看真菌數(shù)量較少，對(duì)于土壤中植物生長(zhǎng)的威脅較小。溫度因子同樣對(duì)放線菌數(shù)量具有顯著影響。隨著土壤溫度的逐漸升高，放線菌數(shù)量呈不斷減少趨勢(shì)，且有機(jī)質(zhì)含量偏低的土壤中放線菌數(shù)量較多。整體來(lái)看，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為5 d時(shí)3種微生物的數(shù)量變化幅度較小。

試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為40 d時(shí)，溫度因子是影響細(xì)菌數(shù)量的最主要因素，有機(jī)質(zhì)含量發(fā)揮次要作用；水分因子是影響真菌數(shù)量的關(guān)鍵因素；放線菌數(shù)量變化無(wú)明顯規(guī)律，水分含量增加時(shí)其數(shù)量略有增加。

試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為130 d時(shí)，水分因子是影響細(xì)菌數(shù)量變化的最主要因素，第130天細(xì)菌數(shù)量極差為1.07×10個(gè) /g，比第 5天的 9.44×10個(gè) /g增加近133倍。溫度因子、有機(jī)質(zhì)含量分別對(duì)真菌、放線菌數(shù)量變化產(chǎn)生主要影響。觀察相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌數(shù)量在第130天達(dá)到峰值；真菌數(shù)量呈先增后降趨勢(shì)，有機(jī)質(zhì)含量與真菌數(shù)量成正比；放線菌數(shù)量呈持續(xù)增加趨勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌、真菌未充分分解化合物的有效分解，但施加肥料條件與放線菌數(shù)量之間未達(dá)到差異顯著水平。由此可知，通過(guò)施加肥料能使細(xì)菌、真菌數(shù)量明顯增多。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，土壤環(huán)境因子對(duì)于微生物數(shù)量具有直接影響，微生物群落對(duì)于溫度變化的響應(yīng)較為靈敏，水分、有機(jī)質(zhì)含量對(duì)不同菌種數(shù)量具有間接影響。在試驗(yàn)前期改變土壤溫度和含水量條件，并適量增施肥料，將使細(xì)菌數(shù)量在發(fā)生大幅變化后逐漸趨于穩(wěn)定，真菌、放線菌數(shù)量變化幅度相對(duì)較小，說(shuō)明細(xì)菌對(duì)于外部環(huán)境條件變化較為敏感、響應(yīng)速度較快，但隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，其環(huán)境適應(yīng)力將逐漸提高，由此促使細(xì)菌群落分布處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。而真菌、放線菌數(shù)量變化幅度相對(duì)較小、敏感性稍差，對(duì)于環(huán)境脅迫存在一定抵御力。從不同試驗(yàn)周期角度進(jìn)行分析，溫度因子在試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為40 d時(shí)對(duì)于細(xì)菌數(shù)量變化起主導(dǎo)作用，在試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為40 d時(shí)對(duì)真菌數(shù)量變化起主導(dǎo)作用，在各時(shí)段均對(duì)放線菌數(shù)量變化起主導(dǎo)作用。自然界的土壤環(huán)境條件不斷發(fā)生變化，受各種環(huán)境因子綜合影響，微生物群落組成和數(shù)量也將不斷變化。在區(qū)域大環(huán)境條件相對(duì)穩(wěn)定的情況下，微生物數(shù)量將與所處小環(huán)境變化密切相關(guān)，使微生物區(qū)系呈現(xiàn)出一定的變化特征。

4 結(jié)論

選取黑鈣土作為介質(zhì)，分別考察有機(jī)質(zhì)含量、溫度和含水量3項(xiàng)因子對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量變化的作用機(jī)制及影響程度，可知短期內(nèi)起到主要作用的為水分因子。但從微生物區(qū)系長(zhǎng)期變化來(lái)看，溫度是影響微生物數(shù)量的最主要因素，有機(jī)質(zhì)含量則在各階段都能對(duì)細(xì)菌和放線菌數(shù)量產(chǎn)生次要影響。但該研究范圍局限于微生物菌群數(shù)量，后續(xù)還需對(duì)不同土壤組分、微生物群落結(jié)構(gòu)特征及不同菌種對(duì)于土壤質(zhì)量的功能作用機(jī)制進(jìn)行深入研討，為土壤微生物區(qū)系變化規(guī)律的研究提供借鑒。