李會(huì)芳，郎 霞，程生輝，王智深

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中 030619）

毛建草（Dracocephalum rupestreHance）[1]又名巖青蘭、毛尖，是唇形科青蘭屬植物，生長(zhǎng)于海拔650～2400米的高山草原、草坡或疏林下陽處，為中國(guó)特有植物品種，主要分布在山西、遼寧、河北、內(nèi)蒙古、青海等地。山西蘆芽山附近的百姓稱其為“毛尖茶”，自古便有將其制茶飲用的習(xí)俗。李慧卿等[2]研究表明毛建草干草中茶多酚含量達(dá)到21%；而馬江媛等[3]研究表明毛建茶中茶多酚含量為僅為4.579%，而兩者研究均表明咖啡堿含量低于其他普通茶品含量，分別為0.622%和0.495%[2?3]。毛建草全草具有較高的藥用價(jià)值，《中藥大辭典》明確其具有清熱消炎、涼血止血的作用，主治外感風(fēng)熱、頭痛寒熱、喉痛咳嗽、黃疸性肝炎、吐血衄血、痢疾[4]。丁聰?shù)萚5]研究表明毛建草中主要含有黃酮類化合物，如北美圣草素、木犀草素、柚皮素-7-0-β-D-葡萄糖苷等，還含有熊果酸、白樺脂酸、間羥基苯甲酸等有機(jī)酸類及Ca、Mg、Fe等微量元素，具有心肌保護(hù)[6?7]、抗氧化[8?9]、抗血小板聚集[10]、降血脂[11]等活性。目前對(duì)毛建茶（草）的活性成分和活性評(píng)價(jià)研究都較薄弱，限制了其進(jìn)一步的開發(fā)利用。

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是指因短期大量飲酒或長(zhǎng)期酗酒造成的肝臟中毒性病理性損害，早期表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎，最終導(dǎo)致肝纖維化和酒精性肝硬化[12]，嚴(yán)重者最終甚至可能惡化為肝癌，對(duì)人們的身心健康造成嚴(yán)重危害。臨床主要特征為惡心、嘔吐、乏力、黃疸并伴有肝臟腫大和壓痛[13]。初期主要特征是肝細(xì)胞中甘油三酯（TG）累積；中期是短期內(nèi)肝細(xì)胞大量壞死引起的一組臨床病理綜合征，可發(fā)生于有或無肝硬化的基礎(chǔ)上；后期是由活化的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（例如膠原）的積累[14]。在中國(guó)，酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升，其危害僅次于病毒性肝炎[15]。Zhu等[16]報(bào)道毛建草提取物對(duì)CCl4致肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用，毛建茶對(duì)酒精性肝損傷是否具有保護(hù)作用未見研究報(bào)道。因此，本文擬采用醉酒模型和慢性酒精性肝損傷模型對(duì)毛建茶的解酒保肝作用進(jìn)行研究，為毛建茶的進(jìn)一步開發(fā)利用和市場(chǎng)推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛建茶 山西省神池縣某毛建茶加工廠；鹽酸納洛酮注射液 海南靈康制藥有限公司（批號(hào)：190101112）；東寶肝泰片 通化東寶藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：180113）；清潔級(jí)昆明種小鼠（雌雄各半，體重：18～20 g） 山西醫(yī)科大學(xué)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)-SCXK（晉）2015-0001；SPF級(jí)SD大鼠（雌雄各半，體重：180～220 g） 山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：20180006003154；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH）、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

DNM-9602酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；Eclipse ci顯微鏡、Digital sight DS-FI2成像系統(tǒng) 日本NIKON公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛建茶水提物的制備 毛建茶1 kg用10倍量水浸泡1 h后，煎煮1 h后濾取茶液，第二次煎煮加8倍量水后煎煮1 h，合并2次茶液，濃縮至0.3 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存待用。實(shí)驗(yàn)過程毛建茶水提物（文中簡(jiǎn)稱毛建茶）高、中、低劑量組灌胃濃度分別為0.3、0.15、0.075 g/mL。

1.2.2 毛建茶解酒作用研究

1.2.2.1 動(dòng)物分組與給藥 昆明小鼠50只飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)普通環(huán)境動(dòng)物房中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為醉酒模型組（D-M）、鹽酸納洛酮組（NH）和毛建茶高劑量組（MJ-H）、中劑量組（MJM）、低劑量組（MJ-L），鹽酸納洛酮組腹腔注射鹽酸納洛酮注射液（0.002 g/kg），毛建茶高、中、低劑量組分別灌胃給予毛建茶水提物3、1.5、0.75 g/kg。

1.2.2.2 醉酒小鼠醉酒時(shí)間、醒酒時(shí)間的測(cè)定 各組提前禁食16 h，毛建茶組按給藥劑量單次灌胃后2 h（醉酒模型組灌服蒸餾水），參考文獻(xiàn)中醉酒模型的造模方法[17?18]，各組灌胃給予50%酒精（20 mL/kg）以造成醉酒模型，鹽酸納洛酮組先給予50%酒精30 min后腹腔注射給予鹽酸納洛酮注射液，觀察并記錄各組醉酒小鼠醉酒時(shí)間（小鼠給予酒精開始到小鼠出現(xiàn)翻正反射消失所用的時(shí)間）和醒酒時(shí)間（小鼠翻正反射消失直到小鼠再次恢復(fù)所消耗的時(shí)間）。灌酒后令小鼠呈仰臥位，若保持背部朝下的姿勢(shì)30 s以上，即認(rèn)為翻正反射消失，則認(rèn)為其醉酒；醉酒后，經(jīng)過一段時(shí)間若翻正反射恢復(fù)，則認(rèn)為其醒酒。

1.2.3 毛建茶對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠的保肝作用研究

1.2.3.1 動(dòng)物造模分組與給藥 60只SD大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)普通環(huán)境動(dòng)物房中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得山西中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成6組：空白組（CON）、慢性酒精性肝損傷模型組（ALI-M）、東寶肝泰組（DBGT, 東寶肝泰片0.36 g/kg）、毛建茶高劑量組（MJ-H, 3 g/kg）、毛建茶中劑量組（MJ-M, 1.5 g/kg）、毛建茶低劑量組（MJ-L, 0.75 g/kg）。各組大鼠上午以濃度為50%酒精1 mL/100 g灌胃，連續(xù)6周以造成慢性酒精性肝損傷模型[19]，空白組給予等體積蒸餾水。各給藥組下午按1 mL/100 g分別灌胃給藥，連續(xù)灌胃6周，每周稱重2次，根據(jù)體重調(diào)整各組給酒量和給藥量，空白組和模型組下午喂以同體積蒸餾水。

1.2.3.2 血清生化指標(biāo)ALT、AST、TC、TG的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第6周結(jié)束，大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，將全血注入空白潔凈試管內(nèi)，離心后（3000 r/min，15 min，4 ℃）分離血清，?80 °C凍存待檢血清。根據(jù)試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中ALT、AST、TC、TG的含量。

1.2.3.3 肝組織中MDA、SOD、GSH的檢測(cè) 末次給藥1 h后，麻醉大鼠采血后，摘取肝臟，稱取0.5 g肝組織于液氮中保存，制備肝勻漿后，蛋白定量后按試劑盒說明書操作，測(cè)定MDA、SOD、GSH的含量。

1.2.3.4 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血后摘取每只大鼠的肝臟，置于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片，H&E染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 毛建茶對(duì)醉酒小鼠醉酒時(shí)間、醒酒時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)過程中D-M組在給予酒精后1.5 h內(nèi)10只小鼠翻正反射全部消失，并持續(xù)至7 h以上，醉酒模型造模成功。如表1所示，與D-M組比較，NH組、MJ-H組、MJ-M組、MJ-L組小鼠的醉酒時(shí)間有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但無顯著差異（P>0.05）；NH組及MJ-H組、MJ-M組、MJ-L組醒酒時(shí)間均極顯著縮短（P<0.01），并存在一定的劑量依賴關(guān)系。與D-M組相比，毛建茶高、中、低劑量組醒酒時(shí)間分別減少了50.80%、47.04%、46.01%，毛建茶能夠極顯著縮短醉酒小鼠的醒酒時(shí)間（P<0.01），具有一定的解酒作用，以高劑量組解酒作用最佳。

表1 毛建茶對(duì)小鼠醉酒時(shí)間、醒酒時(shí)間的影響 （n=10）Table 1 Effect of Maojian tea on the ebriety time and the sober time in mice (n=10)

2.2 毛建茶對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠血清中ALT、AST、TC、TG的影響

正常肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷后，胞內(nèi)的ALT、AST會(huì)透過細(xì)胞膜流入血液中，因此，血清中ALT、AST的活性高低常用以反映肝細(xì)胞損傷程度[20]。如圖1所示，與CON組相比，ALI-M組大鼠血清中的ALT和AST水平顯著升高（P<0.05），慢性酒精性肝損傷模型造模成功；與ALI-M組相比，DBGT組及MJ-H組、MJ-L組大鼠血清中的ALT水平有降低趨勢(shì)，但無顯著差異（P>0.05）；MJ-M組ALT水平顯著降低（P<0.05）；DBGT組及MJ-H組、MJ-M組、MJL組大鼠血清中的AST水平均極顯著降低（P<0.01）。毛建茶低劑量組降低AST作用最佳。

圖1 毛建茶對(duì)大鼠血清中 ALT、AST的影響Fig.1 Effects of Maojian tea on ALT, AST in serum of rats

過量酒精導(dǎo)致肝細(xì)胞膜磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂自由基，導(dǎo)致脂肪酸的β氧化障礙，肝細(xì)胞中TG的代謝紊亂，出現(xiàn)脂肪堆積[21]，因此血清中TC、TG水平高低可以反映肝細(xì)胞脂肪堆積的異常程度。如圖2所示，與CON組相比，ALI-M組大鼠血清中的TC、TG水平顯著升高（P<0.05）；與ALIM組相比，DBGT組TC及TG水平均顯著降低（P<0.05），MJ-H組大鼠血清中的TC水平極顯著降低（P<0.01），MJ-L組大鼠血清中的TG水平極顯著降低（P<0.01）。MJ-H組和MJ-M組大鼠血清中的TG水平以及MJ-L組大鼠血清中的TC水平有下降趨勢(shì)，但無顯著差異（P>0.05）。毛建茶高劑量組和低劑量組能夠改善慢性酒精性肝損傷大鼠的脂肪異常堆積，以低劑量組降低TG作用最佳。

圖2 毛建茶對(duì)大鼠血清中 TC、TG的影響Fig.2 Effects of Maojian tea on TC, TG in serum of rats

2.3 毛建茶對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟中MDA、SOD、GSH的影響

酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的過程中，會(huì)有大量活性氧自由基產(chǎn)生，引起肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物MDA含量增加，并且加快可清除自由基的抗氧化物質(zhì)GSH和SOD的消耗，因此肝組織中MDA、GSH含量及 SOD 活性的高低可以反映肝細(xì)胞氧化損傷程度的大小[19,22]。如圖3所示，與CON組相比，ALI-M組中大鼠MDA指標(biāo)水平較為極顯著升高（P<0.01），GSH和SOD水平極顯著降低（P<0.01）；與ALI-M組相比，DBGT組和MJ-H組MDA指標(biāo)水平極顯著降低（P<0.01），DBGT組和毛建茶各劑量組GSH和SOD的含量極顯著上升（P<0.01）；毛建茶各劑量組能夠明顯改善酒精對(duì)肝細(xì)胞的氧化損傷，以高劑量組效果最佳。

圖3 毛建茶對(duì)大鼠肝臟中 MDA、SOD、GSH的影響Fig.3 Effects of Maojian tea on MDA, SOD, GSH in liver of rats

2.4 毛建茶對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟病理組織變化的影響

如圖4所示，CON組肝細(xì)胞排列整齊，無明顯脂肪空泡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ALD-M組肝組織可見肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)中含有較多小的脂肪空泡；局部靜脈周圍可見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；經(jīng)治療后DBGT組肝組織中無明顯脂肪空泡，偶有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；MJ-H組和MJ-M組仍可見少量小的脂肪空泡，MJ-L組無明顯脂肪空泡，毛建茶各劑量組肝組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。

圖4 毛建茶對(duì)大鼠肝臟病理組織變化的影響（H&E×400）Fig.4 Effect of Maojian tea on liver pathological changes after hematoxylin-eosin（H&E）staining

3 討論與結(jié)論

ALD 是臨床常見的導(dǎo)致肝功能障礙以及肝相關(guān)疾病致死的常見原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，乙醇及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的損傷、氧化應(yīng)激為其主要發(fā)病機(jī)制[23?24]。酒精進(jìn)入人體后主要在肝臟中代謝并產(chǎn)生大量乙醛，乙醛會(huì)上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）促進(jìn)脂肪酸的合成，同時(shí)乙醛抑制DNA結(jié)合能力和過氧化物酶體增殖物激活受體α的轉(zhuǎn)錄活性來抑制脂肪酸氧化，最終導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞內(nèi)積累[25]。酒精攝入人體后主要通過乙醇脫氫酶（ADH）及微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（MEOS）代謝乙醇，誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 2E1 （CYP2E1）表達(dá)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）[26]，代謝產(chǎn)生的乙醛、ROS激活庫普弗細(xì)胞即肝巨噬細(xì)胞促使炎癥反應(yīng)，ROS誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并促使脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物—MDA含量增加[27]，而抗氧化物質(zhì)SOD及GSH含量下降。酒精性肝毒性和酒精代謝引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，加速ALD的進(jìn)展[28]。

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)提出的ALD診療指南，其臨床可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化4個(gè)類型[29]。本文根據(jù)文獻(xiàn)[17]采用連續(xù)6周灌服50%的方法造成慢性酒精性肝損傷模型，引起ALT和AST的輕度升高（以AST升高為主）、血清中TC和TG的輕度升高、肝細(xì)胞中有脂肪空泡出現(xiàn)和輕度的肝臟炎癥，接近ALD早期階段病變-輕癥酒精性肝病，與國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用的慢性酒精喂養(yǎng)模型（Lieber-DeCarli模型）的造模效果相當(dāng)[30]。通常ALT和AST作為肝損傷的敏感指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體攝入過量酒精引起的肝損害使肝細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞漿中的ALT大量釋放進(jìn)入血液，使血清中ALT升高；而當(dāng)酒精引起的肝損傷損害肝細(xì)胞中的線粒體時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量AST釋放到血液中，血清中會(huì)以AST升高為主[31]。本次實(shí)驗(yàn)中慢性酒精性肝損傷模型組雖然ALT和AST都明顯升高，但以AST升高為主，推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)條件下肝細(xì)胞損傷以線粒體損傷為主，肝細(xì)胞膜通透性的影響不顯著，毛建茶高低劑量都未表現(xiàn)出顯著降低ALT作用可能與此原因有關(guān)，以低劑量組降低AST作用最佳。

慢性酒精性肝損傷引起的脂質(zhì)堆積以TG升高為主，本次慢性酒精性肝損傷模型也表現(xiàn)為以TG升高為主，TC僅輕度升高。由于病理切片中肝脂肪變性所形成的細(xì)胞內(nèi)空泡其主要成分是TG，光鏡下觀察毛建茶低劑量組改善脂肪變性的作用最為明顯，與生化指標(biāo)變化一致。毛建茶高劑量組能夠顯著降低TC，低劑量組能夠顯著降低TG 水平，具有一定的降血脂作用，但毛建茶調(diào)節(jié)血脂的劑量關(guān)系有待進(jìn)一步優(yōu)化，今后應(yīng)結(jié)合高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）等載脂蛋白指標(biāo)以及甘油三酯和膽固醇各自的代謝通路進(jìn)一步探討毛建茶降脂作用量效關(guān)系和作用機(jī)制。

本次研究對(duì)毛建茶的解酒和保肝作用進(jìn)行了研究，并從抗氧化損傷角度初步探討了其作用機(jī)制。結(jié)果表明毛建茶高劑量組解酒效果最佳，對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠的肝細(xì)胞保護(hù)和降低TG作用以低劑量組效果最佳，毛建茶各劑量組都具有一定的抗氧化應(yīng)激作用，其中以高劑量組作用最佳。綜上所述，毛建茶具有一定的解酒保肝作用，為其日常應(yīng)用和市場(chǎng)推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。