陳燁媚，張 珅，陳福泉, ，吳光斌，孫閩子，張翼翔，陳發(fā)河,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門 361021）

黃金柰（Prunus salicinaLindl）為柰李類水果中的特色優(yōu)良品種，果體較大，成熟后果皮與果肉呈金黃色，肉質(zhì)厚、口感清甜、富含營養(yǎng)，深受消費者喜愛[1]。黃金柰果實屬于典型的呼吸躍變型果實，成熟和采收均于夏季溫熱時節(jié)，采后代謝旺盛，常溫下后熟現(xiàn)象明顯，后熟過程中果肉迅速軟化，果皮極易失水皺縮，其商品品質(zhì)一般在生理衰老期開始前就因果實軟化和失水而大大降低[2?3]。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）又稱納豆膠，是以谷氨酸為單元體的同質(zhì)多肽，具有良好的水溶性、保水性和生物可降解性。近年來，γ-PGA以其優(yōu)良的成膜性和安全性在食品涂膜保鮮應用方面受到研究人員的關(guān)注[4]。Tao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA水凝膠涂層可以延緩香菇貯藏過程中水分和重量損失，抑制維生素C降解，減少腐爛，延長香菇貯藏期。吳依莎等[6]報道，γ-PGA和淀粉復合涂膜處理能夠延緩櫻桃果實采后失重率的上升，有效抑制總酸代謝和消耗，起到較好的保鮮作用。但是目前有關(guān)γ-PGA在水果保鮮方面的研究多局限于對果實品質(zhì)和貯藏期的影響，而對于與增強耐貯性相關(guān)的生理機制研究鮮見報道，也未有γ-PGA應用于李屬果實保鮮的報道。

因此，本文以黃金柰果實為材料，研究γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏品質(zhì)的影響，并從呼吸代謝這一果實采后核心代謝活動入手，探討γ-PGA處理影響黃金柰果實貯藏品質(zhì)的生理效應機制，為黃金柰果實商品化處理新技術(shù)開發(fā)和γ-PGA在果實保鮮領(lǐng)域的應用提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃金柰果實 采收自福建省古田縣益康園農(nóng)場有限公司果園，于采收當天運至集美大學海洋食品與生物工程學院實驗室，選取大小均一、顏色均勻、無病蟲害、無機械損傷的果實隨機分組，進行試驗處理；γ-PGA（分子量2×106Da，濃度80%） 由山東金洋藥業(yè)有限公司提供；無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸、愈創(chuàng)木酚、葡萄糖、氯化鉀、氫氧化鉀、聚乙烯吡咯烷酮、琥珀酸鈉、牛血清白蛋白、三（羥甲基）氨基甲烷 國藥集團化學試劑有限公司；2,6-二氯酚靛酚鈉、甲硫酚嗪 上海阿拉丁公司；磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶、還原輔酶Ⅰ二鈉鹽、D-果糖-6-磷酸二鈉鹽、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、氧化型輔酶Ⅰ、4-（2-氨乙基）苯磺酰氟鹽酸鹽、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸 源葉生物有限公司；以上試劑 均為分析純。

LE204E托盤電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；GXH-3051H型果蔬呼吸測定儀 上海精密儀器儀表有限公司；SYG-1220數(shù)顯恒溫水浴鍋 美國精騏有限公司；TA. touch型觸摸屏質(zhì)構(gòu)儀 上海保圣實業(yè)發(fā)展有限公司；PSX-330H智能恒溫恒濕箱 寧波萊福科技有限公司；DW-86L388J -80℃超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；WYT-4型手持式折光儀 紹興市億納儀器制造有限公司；RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；T6新世紀-H型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗處理 黃金柰果實經(jīng)清洗、晾干后以4.0 g/Lγ-PGA溶液浸沒果實5 min后取出為涂膜處理，以蒸餾水處理作為對照。果實處理后自然晾干，用聚乙烯薄膜袋打孔包裝，每袋裝果實10個，在（4±1）℃，（85±5）% RH下貯藏，貯藏35 d，從第0 d開始每隔5 d定期取樣測定貯藏品質(zhì)及呼吸代謝相關(guān)指標。

1.2.2 測定指標和方法

1.2.2.1 貯藏品質(zhì) 硬度測定參照Swati等[7]的方法，用打孔器在去皮的黃金柰果實的赤道部位取圓柱形果肉，采用PT-1探頭測定，測試時下壓速度為1.0 mm/s，最小觸發(fā)力0.5 N，形變量30%。

失重率采用失重法[8]；可溶性固形物（total soluble solids，TSS）含量測定參照Burdon等[9]的方法。取去皮黃金柰赤道中心的果肉，用手持式折光儀測定，以質(zhì)量分數(shù)（%）表示。

好果率的測定：參照Tian等[10]的方法進行分級：1～2級果：新鮮完好，果皮無褐變或斑點面積小于1/4，果肉色澤、風味正常，無長霉。計算1～2級黃金柰總果數(shù)占隨機選取總數(shù)的百分比。

1.2.2.2 呼吸速率 呼吸速率參照葉建兵等[11]的方法，取黃金柰放入GXH-3051H型果蔬呼吸測定儀中測定單位小時內(nèi)生成CO2的量，結(jié)果以CO2mg·kg?1·h?1表示。

1.2.2.3 呼吸代謝底物和中間產(chǎn)物 葡萄糖含量參照Gao等[12]的方法，稱取2.0 g果肉，用蒽酮試劑沸水浴顯色反應，在625 nm處測吸光值，以葡萄糖溶液制作標準曲線計算樣品中的葡萄糖含量。

丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸含量參照段云飛等[13]的方法，采用高效液相色譜法，稱取15.0 g黃金柰果肉，研成勻漿，加入適量的流動相溶液，水浴加熱浸提45 min，冷卻后定容，12000 r/min離心30 min，分離沉淀蛋白質(zhì)、果膠等干擾物質(zhì)，取上清液用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，濾液即為樣液。用丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸標準品制備單一標準液并制作標準曲線；分別移取適量的各單一標準液，稀釋得到梯度混合標準液。液相色譜條件設置為：Atlanis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相是pH為2.2的0.02 mol/L NaH2PO4緩沖溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脫（0 min 0% B；8 min 15% B；17 min 30% B；26 min 0% B），柱溫25 ℃，流速為0.5 mL/min，檢測波長為213 nm，進樣量為10 μL。結(jié)果以mg/mL表示。

1.2.2.4 糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性 己糖激酶（hexokinase，HK）活性測定參照劉麗杰[14]的方法，以在340 nm處吸光值每變化0.1為一個活力單位（1 U）；磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）活性參照Angelika等[15]的方法，以1 min內(nèi)吸光值每增加1個單位為1 U；丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性參照Sébastien等[16]的方法，以1 min內(nèi)吸光值每增加0.001個單位為1 U。

1.2.2.5 三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性 檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）活性參照Jenner等[17]的方法，以1 min內(nèi)吸光值每增加1個單位為1 U；α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDHC）活性參照Ji等[18]的方法，以1 min內(nèi)吸光值每增加1個單位為1 U；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性參照Aghdam等[19]的方法。以1 min內(nèi)吸光值每增加0.01個單位為1 U。最終單位為U/mg protein。果肉可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250染色法進行測定，以牛血清蛋白做標準曲線[20]。（y=0.418x+0.0582，R2=0.9985）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理統(tǒng)計，計算標準誤差并作圖；應用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA），利用Duncan’s多重式比較差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著（*），P<0.01表示差異極顯著（**）。

在當前的地鐵隧道工程中，初期支護在整個工程中有重要的作用。初期支護主要包括砂漿錨桿施工、鋼架安裝等施工內(nèi)容。鋼架安裝工程施工時，首先要選擇合適的鋼架安裝位置，安裝時，要對鋼架的基腳處留有一定的原巖空間，將鋼架架設在挖槽中。其次，對鋼架結(jié)構(gòu)進行安裝時，要保證鋼架平面垂直于隧道中線，傾斜角度及其安裝偏差要控制在合理范圍內(nèi)[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-PGA處理對黃金柰果實的貯藏品質(zhì)影響

2.1.1 對硬度的影響 如圖1所示，黃金柰果實硬度在貯藏前15 d內(nèi)快速降低，隨后緩慢下降，表明黃金柰在貯藏前期經(jīng)歷了快速的采后成熟過程，果實明顯軟化，而隨著后熟的完成，在貯藏后期（15～35 d）果實軟化幅度不大。與對照果實相比，經(jīng)γ-PGA處理的黃金柰果實硬度在前10 d下降較緩慢，且在5～10 d極顯著高于對照果實（P<0.01）。

圖1 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間硬度的影響Fig.1 Effect of γ-PGA treatment on the firmness of ‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.1.2 對失重率的影響 圖2表明，黃金柰果實的失重率在貯藏前10 d快速上升，隨后緩慢升高；與對照果實相比，γ-PGA處理果實的失重率上升較緩慢，在貯藏期內(nèi)均低于對照果實。

圖2 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間失重率的影響Fig.2 Effect of γ-PGA treatment on the weight loss rate of‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.1.3 對TSS含量的影響 由圖3可知，無論采用γ-PGA處理與否，采后黃金柰果實果肉TSS含量在貯藏期間均呈先上升后下降的趨勢。但對照果實TSS含量在第15 d達到峰值，隨后快速下降；而γ-PGA處理果實的TSS含量在第20 d達到峰值，之后緩慢下降，且在10～35 d顯著高于對照果實（P<0.05）。

圖3 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間TSS含量的影響Fig.3 Effect of γ-PGA treatment on the total soluble solids content of ‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.1.4 對好果率的影響 圖4表明，采后黃金柰果實在貯藏前5 d均維持在較好狀態(tài)，隨后不斷降低。對照果實好果率在5～35 d迅速下降，貯藏35 d時僅為61.33%；而γ-PGA處理果實好果率在貯藏前15 d變化不大，在貯藏中后期（15～35 d）逐漸下降，在貯藏第35 d好果率比對照果實高17.34%。

圖4 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間好果率的影響Fig.4 Effect of γ-PGA treatment commercially acceptable fruit rate of ‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.2 γ-PGA處理對黃金柰果實呼吸速率的影響

如圖5所示，黃金柰果實在貯藏第10 d和25 d出現(xiàn)兩個呼吸高峰，且第二次呼吸高峰值高于第一次。與對照果實相比，γ-PGA處理果實的呼吸速率在貯藏5～25 d和35 d均較低，且呼吸高峰值較低，表明γ-PGA處理抑制了黃金柰果實的采后呼吸作用。

圖5 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間呼吸速率的影響Fig.5 Effect of γ-PGA treatment on the respiration rate of‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.3 γ-PGA處理對黃金柰果實糖酵解代謝的影響

2.3.1 對葡萄糖和丙酮酸含量的影響 如圖6A 所示，隨貯藏時間的延長，兩組黃金柰果實的葡萄糖含量均逐漸降低。但與對照果實相比，經(jīng)γ-PGA處理的黃金柰果實葡萄糖含量在前30 d保持了較高水平，在第10、15 d極顯著高于對照果實（P<0.01）。圖6B 表明，黃金柰果實的丙酮酸含量隨貯藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢。對照組果實的丙酮酸含量在前5 d緩慢上升，隨后持續(xù)下降；經(jīng)γ-PGA處理黃金柰的丙酮酸含量在前5 d快速上升，隨后緩慢下降，并在此期間顯著高于對照果實（P<0.05）。

圖6 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間葡萄糖（A）和丙酮酸（B）含量的影響Fig.6 Effects of γ-PGA treatment on the contents of glucose（A） and pyruvate （B） of ‘Golden Younai’ plum fruit during storage

2.3.2 對HK、PFK和PK活性的影響 如圖7A 所示，對照組黃金柰果實的HK活性在前5 d緩慢下降，隨后快速升高；與對照果實相比，經(jīng)γ-PGA處理果實的HK活性在前5 d迅速降低，隨后變化不大，且極顯著低于對照果實（P<0.01）。由圖7B 可知，對照組黃金柰果實的PFK活性在前5 d緩慢上升，隨后逐漸下降；而經(jīng)γ-PGA處理的果實PFK活性在前5 d快速升高，隨后逐漸降低，但均高于對照果實。圖7C表明，黃金柰果實的PK活性隨著貯藏時間的延長逐漸降低，其中對照組黃金柰果實的PK活性在前10 d快速下降，隨后緩慢下降；與對照果實相比，γ-PGA處理組果實的PK活性下降幅度較小，且在10～35 d顯著高于對照果實（P<0.05）。

2.4 γ-PGA處理對黃金柰果實三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物含量和酶活性的影響

由圖8B 可以看出，對照組黃金柰果實的琥珀酸含量在前5 d快速下降，5～25 d緩慢下降，隨后變化不大；γ-PGA處理果實的琥珀酸含量變化趨勢與對照果實相似，但其含量在5～20 d和30～35 d顯著低于對照果實（P<0.05）。由圖8C 可知，對照組黃金柰果實蘋果酸含量在前5 d略有升高，5～25 d緩慢下降，隨后快速降低；經(jīng)γ-PGA處理的黃金柰果實蘋果酸含量的變化趨勢與對照果實相近，但在貯藏期內(nèi)極顯著高于對照果實（P<0.01）。

圖8 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間檸檬酸（A）、琥珀酸（B）和蘋果酸（C）含量的影響Fig.8 Effects of γ-PGA treatment on the contents of citric acid（A）, succinic acid （B） and malic acid （C） of ‘Golden Younai’plum fruit during storage

如圖9A 所示，黃金柰果實的CS活性隨著貯藏時間的延長不斷降低，其中，γ-PGA處理黃金柰果實的CS活性下降趨勢較對照果實緩慢。由圖9B 可得，對照組黃金柰果實的α-KGDHC活性在前5 d快速下降，隨后緩慢下降；而γ-PGA處理組黃金柰果實的α-KGDHC活性在前5 d迅速下降，隨后維持在低水平，在貯藏期內(nèi)極顯著低于對照果實（P<0.01）。圖9C 表明，隨著貯藏時間的延長，黃金柰果實SDH活性逐漸下降，γ-PGA處理果實的SDH活性在前30 d顯著低于對照果實（P<0.05）。

圖9 γ-PGA處理對黃金柰果實貯藏期間檸檬酸合酶（A）、α-酮戊二酸脫氫酶（B）和琥珀酸脫氫酶（C）活性的影響Fig.9 Effects of γ-PGA treatment on the activities of citrate synthase （A）, α-ketoglutarate dehydrogenase （B） and succinate dehydrogenase （C） of ‘Golden Younai’ plum fruit during storage

3 討論

黃金柰作為李屬果實，是典型的呼吸躍變型水果。呼吸作用作為果實物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化的中樞，果實后熟過程中的失水失重以及淀粉、果膠等大分子有機物降解引起的果實硬度下降和TSS含量的增加等皆與呼吸代謝密切相關(guān)[21]。涂膜處理是李屬果實常見的保鮮處理手段，可以延緩果實失水，抑制呼吸作用，減少水分和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，延長果實貨架期[22]。本研究同樣表明，γ-PGA處理延緩了黃金柰果實貯藏期間呼吸速率的上升并降低呼吸高峰值，減緩果實硬度在貯藏前期的下降，抑制貯藏期內(nèi)果實失重，促進果實TSS含量升高并延緩其下降，維持了果實較高的好果率。結(jié)果表明γ-PGA處理延緩了黃金柰果實采后成熟和衰老，對果實品質(zhì)劣變起到了良好地抑制作用。

作為采后果蔬的代謝中心，呼吸作用的強弱反映了果實生命活動的狀態(tài)，與呼吸代謝途徑的變化有關(guān)[23]。糖酵解-三羧酸（EMP-TCA）循環(huán)是呼吸代謝的主途徑，調(diào)控EMP-TCA途徑變化可對采后果實呼吸作用的貯藏品質(zhì)形成重要影響。糖酵解是碳水化合物代謝氧化降解的初始階段和基本途徑[24]。HK催化己糖磷酸化，是EMP的第一個不可逆反應。PFK和PK均是催化EMP途徑中不可逆反應的限速酶，其中，PK催化磷酸烯醇式丙酮酸生成EMP環(huán)節(jié)的終產(chǎn)物丙酮酸，丙酮酸以乙酰CoA形式進入線粒體TCA。研究表明，NO處理番茄果實可以降低貯藏期間呼吸速率，抑制HK、PFK、PK等呼吸速率相關(guān)酶活性，延遲番茄果實的采后成熟[25]。本研究表明，貯藏期間對照黃金柰果實的葡萄糖含量不斷降低，而HK活性升高，二者呈極顯著負相關(guān)（r=?0.913**）。經(jīng)γ-PGA處理的果實保持了較高的葡萄糖含量和較低的HK活性，而其丙酮酸含量、PFK和PK活性在貯藏期內(nèi)均較高，表明γ-PGA處理可能通過抑制HK活性來維持呼吸底物水平，延緩呼吸作用，并且可能通過抑制EMP下游的PFK和PK活性下降，維持丙酮酸含量的緩慢下降。

TCA循環(huán)的運行需要一系列酶的參與，通過酶促反應提供電子進入線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈完成氧化磷酸化[14]。其中，CS是TCA循環(huán)的第一個關(guān)鍵酶其催化乙酰CoA和草酰乙酸縮合形成檸檬酸[26?27]。α-KGDHC催化α-酮戊二酸生成琥珀酰CoA。SDH催化琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸，是TCA循環(huán)中唯一位于線粒體內(nèi)膜的酶[28]。Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，采用殼聚糖涂膜處理柚子果實，可以維持較高的SDH活性參與TCA循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA處理保持了果實較高的檸檬酸和蘋果酸含量，以及較高的CS活性，結(jié)合γ-PGA處理延緩了果實丙酮酸含量下降，可認為該處理在抑制呼吸作用過程中，維持了TCA循環(huán)的主要代謝物檸檬酸和蘋果酸含量。此外，γ-PGA處理促進了果實琥珀酸含量以及α-KGDHC與SDH活性的降低，據(jù)此推測較低的琥珀酸含量可能是由于上游α-KGDHC活性較低，而較低的SDH活性則表明γ-PGA處理抑制了TCA循環(huán)的總體運行。

4 結(jié)論

采用γ-PGA對黃金柰果實進行涂膜處理，可以延緩采后黃金柰果實在冷藏條件下的軟化和失重，保持較高的TSS含量和好果率，這些作用可能與果實呼吸速率受抑制有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA處理可通過抑制EMP中HK活性、維持PFK和PK活性，延緩葡萄糖和丙酮酸含量降低；γ-PGA處理可通過維持TCA循環(huán)中CS活性延緩檸檬酸含量降低，還可促進果實α-KGDHC活性和琥珀酸含量下降，并降低SDH活性，延緩TCA循環(huán)運行，減少蘋果酸消耗。因此，4 g/Lγ-PGA涂膜處理可通過影響采后黃金柰果實呼吸代謝EMP-TCA途徑的運行，維持底物和中間代謝物水平，延緩果實呼吸作用，減少物質(zhì)消耗，維持果實貯藏品質(zhì)，延長貨架期。