王 芳，劉 騫，于 棟，連軍強，劉懷偉,

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 215008；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.成都希望食品有限公司，四川成都 610000）

冷卻肉是指嚴格執(zhí)行獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫制度屠宰后的畜體，迅速進行冷卻處理，使肉溫在24 h內(nèi)降為0～4 ℃的生鮮肉，也稱之為排酸肉、預冷肉[1]。冷卻肉具有鮮嫩、美味等優(yōu)點，深受消費者喜愛[2?3]。但是冷卻肉貨架期較短，嚴重影響其商業(yè)價值[4?5]。因此對冷卻肉采用適當?shù)陌b方法延長其貨架期勢在必行。目前，對于冷卻肉的保鮮方法主要有托盤、真空、氣調和活性包裝[6?7]。其中氣調包裝因其具有良好的護色效果得到了消費者的認可[8]。但是冷卻肉在氣調包裝中存放一段時間后會滲出大量肉汁降低冷鮮肉感官品質，另外肉汁積聚于包裝盒底部會導致微生物快速繁殖使冷鮮肉產(chǎn)生異味，縮短貨架期。目前市售無塵紙吸水墊被廣泛放置在氣調包裝中用來吸收滲出的血水，以此來改善包裝內(nèi)部的衛(wèi)生環(huán)境[9]。其是以全木漿纖維為原料，采用氣流成網(wǎng)的技術制備的非織造布，在制作過程中使用空氣作為分散和輸送纖維的介質，依靠高分子粘合劑或熱熔性纖維本身熔融結合使纖維固定在網(wǎng)簾上制成[10]。市售無塵紙吸水墊的吸附原理是物理吸附，血水可通過毛細作用被運輸?shù)讲牧系膬?nèi)部，但是無塵紙吸水墊吸收血水能力和抑制腐敗菌繁殖能力有限，對冷卻肉的保鮮效果并不理想[11]。因此，亟需制備一種兼具高吸水性和抑菌性的吸水墊。

近年來，靜電紡絲技術在食品包裝領域備受關注。利用靜電紡絲技術制備的吸水墊具有孔隙率大、比表面積高等優(yōu)點[12?13]，有較強的吸水和鎖水能力。即使施加外在壓力，吸附的水分也很難流出，其可作為一種新型吸水材料應用于冷卻肉保鮮中。另外靜電紡絲技術還具備優(yōu)異的包埋特性，可以有效的將天然抑菌劑（丁香酚、迷迭香酚和肉桂醛等）包埋到納米纖維吸水墊中制備活性包裝材料[14]。其中，丁香酚是一種從植物中提取的天然香料，具有抗菌和抗氧化等生物活性。Kayaci等[15]利用靜電紡絲技術包埋丁香酚制備了抑菌納米纖維膜，研究結果表明被包埋的丁香酚可以從納米纖維膜中緩慢穩(wěn)定釋放，其在活性包裝方面具有廣闊的應用前景。

本文基于靜電紡絲技術制備了包埋丁香酚的抑菌納米纖維吸水墊。分別對冷卻肉使用市售無塵紙吸水墊和抑菌納米纖維吸水墊進行氣調包裝保鮮處理，研究比較了市售無塵紙吸水墊和抑菌納米纖維吸水墊對冷卻肉貯藏期內(nèi)的pH、硫代巴比妥酸值、TVB-N值、菌落總數(shù)值、蒸煮損失率、汁液流失率、顏色變化和微生物菌落結構變化等，以期為抑菌納米纖維吸水墊應用于冷鮮肉貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬里脊肉 哈爾濱比優(yōu)特超市；市售生鮮無塵紙吸水墊 上海通貝吸水材料有限公司；平板計數(shù)瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司；檸檬酸（Citric acid, CA） 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol, PVA） 上海邁瑞爾化學技術有限公司；丁香酚（eugenol） 上海源葉生物科技有限公司；硫代巴比妥酸 純度97%，上海科豐化學試劑有限公司；三氯乙酸 純度99%，成都市科龍化工試劑廠；氯化鈣 食品級，浙江巨化股份新聯(lián)化工有限公司。

高壓靜電紡絲機DFS-001 北京新凱偉科技有限公司；掃描電子顯微鏡SU8010 日本日立集團；氣調包裝機 江蘇大江智能裝備有限公司；FE20K pH計 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；RW20機械攪拌機 德國IKA公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；ZE-6000型色差儀 日本登宿株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌納米纖維吸水墊的制備 根據(jù)前期實驗結果確定以下實驗步驟及設備參數(shù)如圖1。配制靜電紡絲溶液：首先稱取1.5 g聚乙烯醇粉末置于20 mL雙蒸水中，90 ℃水浴加熱2 h，磁力攪拌至完全溶解后得到7.5%（w/v）的聚乙烯醇溶液。然后向聚乙烯醇溶液中加入0.14 g檸檬酸，磁力攪拌至完全溶解后向其中加入一定量的丁香酚，最終配制成含有0%、5%、10%、15%、20%（w/w，以聚乙烯醇質量計）丁香酚的靜電紡絲溶液。

圖1 抑菌納米纖維吸水墊制作流程圖Fig.1 Production flow chart of antibacterial nanofiber absorption mats

制備抑菌納米纖維吸水墊：將配制好的溶液轉移至10 mL注射器中進行靜電紡絲，電壓設置為15 kV，推進速度設置為0.24 mL/h，接收距離設置為12 cm。將制備的納米纖維墊進行加熱交聯(lián)處理（130 ℃，8 min），加熱處理后便得到了含有不同丁香酚濃度的抑菌納米纖維吸水墊。

1.2.2 樣品準備及貯藏 購買新鮮冷卻里脊肉作為實驗原料，切成4 cm×4 cm×2 cm的肉塊，分別放置在不同托盤包裝中?？瞻捉M托盤包裝中無吸水墊，本實驗從超市購買無塵紙吸水墊作對比，記為無塵紙組。實驗制備的含有不同丁香酚濃度（0%、5%、10%、15%、20%）的抑菌納米纖維吸水墊，分別記為AP-0、AP-5、AP-10、AP-15、AP-20。冷卻肉樣品放置完成后向其中充入氣調保鮮氣體，氣體比例為50%O2/40%CO2/10%N2。包裝完成后置于4 ℃貯藏，在貯藏期間內(nèi)每3 d取樣測定理化指標。菌落結構樣品選用貯藏時間為15 d的冷卻肉進行分析測試。

1.2.3 pH測定 參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH測定》進行測定[16]。

1.2.4 脂質過氧化值測定 參考Sun等[17]的方法，測定硫代巴比妥酸反應物含量。將2 g樣品放入試管中，加入3 mL硫代巴比妥酸溶液和17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，混合均勻后沸水浴加熱30 min。待溶液冷卻后取4 mL上清液與4 mL氯仿混勻，然后3000 r/min離心10 min。最后取上清液在532 nm波長處測其吸光值。根據(jù)以下公式計算：

式中：A532nm為溶液吸光度；m為樣品的質量，g；9.48為常數(shù)。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮值測定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中半微量定氮法進行測定[18]。

1.2.6 菌落總數(shù)值測定 參照GB/T 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》進行試驗[19]。

1.2.7 色差測定 色澤的測定根據(jù)Jia等[20]所描述的方法，用ZE-6000色差儀（日本東京Juki公司）測量樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。使用D65光源和10°觀察角8 mm直徑測量區(qū)域來表示結果。

1.2.8 蒸煮損失值測定 參考Faridnia等[21]的方法測定蒸煮損失并稍作修改。首先用濾紙擦干樣品表面水分，記為Wq（g），然后在85 ℃的水浴鍋中加熱至樣品的中心溫度達到75 ℃，冷卻至室溫后用濾紙擦干樣品表面水分，稱重記為Wh（g）。蒸煮損失計算如下：

1.2.9 汁液流失值測定 樣品的汁液流失率參考Ye等[22]的方法測量并進行適當修改。包裝之前對各組樣品進行稱重記為W1（g），然后用濾紙擦干樣品表面水分稱重記為W2（g），結果取3次平均值。汁液流失率按如下公式計算：

1.2.10 微生物菌落結構測定 根據(jù)Hu等[23]的方法，使用NovaSeq6000進行上機測序。對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進行操作分類單元聚類和物種分析，通過物種注釋及豐度，分析微生物菌群結構。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進行了三次獨立試驗，結果表示為平均值±標準差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul, MN）利用軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD檢驗程序。采用Sigmaplot 12.5作圖軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 pH分析

豬肉在冷藏過程中pH的變化如圖2所示。七組豬肉樣品的pH隨貯藏時間的延長均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，貯藏至第6 d時pH最低，這是可能是因為乳酸積累的影響[24]。另外，氣調包裝氣體中含有二氧化碳，二氧化碳溶于血水中會生成碳酸，也會導致鮮肉表面pH下降。此后微生物和酶分解蛋白質產(chǎn)生堿性物質導致冷卻肉pH逐漸上升[25?26]。在貯藏期內(nèi)，各處理組pH整體低于空白組，其中無塵紙組和AP-0組pH無顯著性差異（P>0.05）。第6至第12 d時含有丁香酚的納米纖維吸水墊組pH顯著低于無塵紙組和AP-0組（P<0.05）。在貯藏過程中，不同丁香酚添加量對冷卻肉pH的影響不同。其中，AP-15組的pH低于AP-20組，這可能與納米纖維吸水墊的吸水效果有關。當丁香酚添加量達到20%時，會影響納米纖維微觀形貌進而降低納米纖維吸水墊的吸水能力。從而使得AP-15組冷卻肉在貯藏期內(nèi)的pH最低。

圖2 冷卻肉貯藏過程中pH的變化Fig.2 Changes in pH value of chilled meat during storage

2.2 脂質過氧化物分析

脂肪氧化是冷卻肉貯藏過程中品質變差的主要原因之一，可使冷卻肉顏色改變、風味變差以及營養(yǎng)物質被破壞，TBARS值可以表示脂肪氧化的程度[27]。如圖3所示，隨著貯藏時間延長，樣品的TBARS值均呈上升趨勢。在第6至第18 d時，空白組樣品的TBARS值顯著高于其他各組（P<0.05），空白組冷卻肉的TBARS在第9 d時就已經(jīng)臨近0.5 mg/kg。這是因為吸水墊處理可以吸收冷卻肉流出的肉汁，減少脂肪氧化。另外，由于AP-0組吸水墊的吸水能力高于無塵紙組，所以在貯藏期內(nèi)，AP-0組TBARS值整體低于無塵紙組。添加丁香酚的處理組對脂肪氧化的抑制作用更加明顯，在貯藏18 d時TBARS值均低于0.5 mg/kg，其中丁香酚添加量為15%時，樣品的TBARS值最低。說明向吸水墊中添加丁香酚可以更好的延緩脂肪氧化。

圖3 冷卻肉貯藏過程中TBARS的變化Fig.3 Changes in TBARS value of chilled meat during storage

2.3 揮發(fā)性鹽基氮分析

食品由于酶和細菌的作用，使蛋白質分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質，這些物質被稱為揮發(fā)性鹽基氮[28]。根據(jù)GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》規(guī)定，TVB-N值的評價標準為：鮮肉≤20 mg/100 g。由圖4可知，空白組TVB-N隨著貯藏時間的延長快速上升，其增長速度高于其他處理組。當貯藏第12 d時，空白組肉樣中TVB-N含量達到22 mg/100 g。當貯藏第15 d時，無塵紙組和AP-0組TVB-N的值分別為23和21 mg/100 g。但是，添加丁香酚吸水墊組的冷卻肉仍未超標。其中，AP-15組TVB-N值最低，在貯藏18 d時其TVB-N值為22 mg/100 g，超出標準。結果說明，靜電紡絲工藝可以更大程度發(fā)揮材料吸水能力和丁香酚的抑菌作用，抑菌納米纖維吸水墊對冷卻肉有良好的保鮮效果。

圖4 冷卻肉貯藏過程中TVB-N的變化Fig.4 Changes in TVB-N value of chilled meat during storage

2.4 菌落總數(shù)分析

豬肉在貯藏過程中菌落總數(shù)變化見圖5。菌落總數(shù)的對數(shù)值lg（CFU/g）≤4時為一級鮮度，在4～6之間為二級鮮度，大于6時為變質肉[29]。在貯藏過程中，空白組樣品的菌落總數(shù)明顯上升，且增長速度明顯高于其它處理組。貯藏至12 d時，空白組中冷卻豬肉菌落總數(shù)已超過了6.0 lg（CFU/g），說明肉已經(jīng)變質。此時無塵紙組和AP-0組的菌落總數(shù)存在顯著性差異（P<0.05），分別為5.95和5.76 lg（CFU/g），這說明使用吸水墊處理可以減少微生物的繁殖。隨著丁香酚的加入，抑菌納米纖維吸水墊組的菌落總數(shù)低于無塵紙組和AP-0組。這是因為當抑菌納米纖維吸水墊發(fā)生溶脹時，可以釋放出丁香酚至鮮肉表面以此抑制微生物繁殖[30?31]。冷卻肉的菌落總數(shù)與吸水墊的吸水能力和丁香酚含量密切相關，雖然AP-20組丁香酚含量最高，但其吸水能力低。故抑菌效果最好的處理組為AP-15組，在貯藏15 d時菌落總數(shù)為5.64 lg（CFU/g），明顯低于其余各處理組。這也說明抑菌紡絲吸水墊應用在肉類保鮮中可以有效的減緩肉類細菌的增長。

圖5 冷卻肉貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig.5 Changes in TBC value of chilled meat during storage

2.5 色差分析

在4 ℃的冷藏條件下，測定冷卻肉在冷藏過程中色值（L*：亮度，a*：紅度，b*：黃度）變化，其結果如表1～表3所示。

表3 不同肉樣在冷藏過程中b*值的變化Table 3 Changes of b* value of different meat samples during refrigeration

由表1可知，各處理組的L*值均逐漸減小，說明各處理組亮度值降低，這是因為肉樣在微生物的作用下減弱自身還原體系，僅有少量高鐵肌紅蛋白被還原為肌紅蛋白，從而導致亮度值下降[32]?？瞻捉M亮度下降速度最快，在第18 d時亮度值由55.20降為37.00，降低幅度為32.9%。在18 d時，無塵紙組肉樣的L*值降低了54.4%，AP-0組降低了22.2%。添加丁香酚可以延緩亮度值下降，具體表現(xiàn)為AP-5組、AP-10組、AP-15組、AP-20組的L*值分別降低了19.4%、12.7%、8.2%、16.4%。

表1 不同肉樣在冷藏過程中L*值的變化Table 1 Changes of L* value of different meat samples during refrigeration

從表2中可以看出，各處理組的a*值隨貯藏時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，鮮肉顏色上升可能是包裝內(nèi)部氧氣濃度高于空氣，促使鮮肉中氧合肌紅蛋白快速生成。隨著貯藏期延長，a*值又開始逐漸下降，并且所有處理組下降幅度各不相同。其中，空白組的下降速率最快，在第9 d的時候，其肉表面顏色已呈現(xiàn)褐色，這是由于冷卻肉中氧合肌紅蛋白被氧化成高鐵肌紅蛋白，導致顏色呈褐色。a*值的下降速率從高到低依次為空白組>無塵紙組>AP-0組>AP-5組>AP-10組>AP-20組>AP-15組。

表2 不同肉樣在冷藏過程中a*值的變化Table 2 Changes of a* value of different meat samples during refrigeration

由表3可以看出，各處理組的b*值均逐漸減小，說明冷卻肉黃度值降低?？瞻捉M下降速率顯著高于其余各組（P<0.05）。第18 d時黃度值由13.32降為7.62，降低幅度為4.3%。其余各組的b*值下降幅度不明顯，到第18 d時各組黃度值沒有顯著性差異（P＞0.05）。

綜合以上結果，可以得出AP-15組對氣調包裝中冷卻肉保鮮效果最為明顯，因此選擇空白組、無塵紙組和AP-15組進行微生物菌落結構分析。進一步探究氣調包裝中冷卻肉細菌多樣性和菌落結構的變化。

2.6 蒸煮損失分析

圖6表示各組冷卻肉在貯藏期間蒸煮損失的變化情況。由圖6可知，各組的蒸煮損失隨貯藏時間的延長而增加，其中空白組上升速率最大。貯藏前3 d各組冷卻肉的持水能力無顯著性差異（P＞0.05）。在貯藏過程中，空白組蒸煮損失顯著高于其他處理組（P<0.05）。這是因為吸水墊處理可以吸收血水，抑制微生物生長繁殖，減少肌肉組織中蛋白質的分解腐敗，改善鮮肉的pH從而降低鮮肉的蒸煮損失。添加丁香酚的納米纖維吸水墊可以更好的抑制微生物生長繁殖，在貯藏過程中AP-15組冷卻肉蒸煮損失最低。

圖6 冷卻肉貯藏過程中蒸煮損失的變化Fig.6 Changes in cooking loss value of chilled meatduring storage

2.7 汁液流失分析

冷卻肉在貯藏的過程中，會滲出血水產(chǎn)生汁液流失，導致蛋白質氧化，還會直接影響產(chǎn)品感官品質和經(jīng)濟效益。圖7為不同吸水墊處理對冷卻肉汁液流失率的影響。由圖7可知，冷卻肉的汁液流失率隨貯藏時間的增加而增大，其中空白組汁液流失上升速率最大。從圖中可以看出使用吸水墊可以降低冷卻肉的汁液流失，其中AP-0組吸水墊的汁液流失率低于無塵紙組。添加丁香酚后，冷卻肉的汁液流失率增長緩慢。汁液流失的根本原因在于蛋白質氧化后其膠體結構發(fā)生了不可逆的變化使原來處于凝膠結構中的水分流出[33]。而抑菌吸水墊中加入丁香酚可以延緩蛋白質氧化，進而減少汁液流失。其中，AP-10組和AP-15組控制冷卻肉汁液流失的效果相對較好。

圖7 冷卻肉貯藏過程中汁液流失的變化Fig.7 Changes in drip loss value of chilled meat during storage

2.8 微生物菌落結構分析

2.8.1 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性指數(shù)可以對微生物物種豐富度和均勻度進行評估[34]。如表4所示，所有樣品的物種覆蓋率均高于0.99，說明所建立的文庫科學有效，能反映冷卻肉中微生物的多樣性。觀測到AP-15組的物種數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高，其次是空白組。表明AP-15組的菌群豐度和菌群多樣性最高。與之相比空白組有所降低，無塵紙組則明顯低于其他兩組。稀釋曲線是依據(jù)測序量與對應物種數(shù)目構建的，如圖8所示，隨著橫坐標的增加，三條曲線都趨于平坦，說明新檢測到的菌群物種越來越少，測序深度科學合理。

表4 Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity indices

圖8 樣品稀釋曲線Fig.8 Sample of dilution curve

2.8.2 物種相對豐度 冷卻肉中最常見的污染菌主要包括：微球菌、葡萄球菌、腸桿菌科、棒桿菌屬、熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和乳桿菌屬。結果表明本實驗應用NovaSeq測序平臺方法鑒定冷卻肉冷藏過程中菌相結果與大多數(shù)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的研究報告相一致[35]。物種相對豐度柱形累加圖如圖9所示，其可以直觀體現(xiàn)每組樣品屬水平上相對豐度較高的物種及其比例。從空白組中可以看出熱死環(huán)絲菌屬、假單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬相對豐度明顯高于其他菌屬，分別占據(jù)62.17%、13.68%和12.87%。無塵紙組相對豐度較高的菌屬分別是熱死環(huán)絲菌屬（40.88%）、鏈球菌屬（5.42%）和發(fā)光桿菌屬（4.93%）。AP-15組的優(yōu)勢菌屬和另外兩組明顯不同，其中鞘氨醇單胞菌和乳酸桿菌屬相對豐度較高，分別占據(jù)3.85%和2.76%。相對豐度柱形圖可以說明空白組的主要腐敗菌是熱死環(huán)絲菌屬、假單胞菌屬和發(fā)光菌屬。添加無塵紙吸水墊處理可以降低熱死環(huán)絲菌屬、假單胞菌屬和發(fā)光菌屬的相對豐度，這可能是吸水墊處理提高了冷卻肉包裝內(nèi)部衛(wèi)生環(huán)境導致的。由于丁香酚具有良好的抑菌效果，使用抑菌紡絲吸水墊處理后熱死環(huán)絲菌屬、假單胞菌屬和發(fā)光菌屬的相對豐度明顯低于空白組和無塵紙組。

圖9 冷卻肉貯藏15 d微生物屬水平相對豐度柱形累加圖Fig.9 Histogram of relative abundance on microbial genus level in chilled meat storage for 15 days

3 結論

本文基于靜電紡絲技術制備了包埋丁香酚的抑菌納米纖維吸水墊。包裝盒中內(nèi)置吸水墊處理可以提高包裝內(nèi)部的衛(wèi)生條件，延緩微生物繁殖，達到延長貨架期的效果。而丁香酚和吸水墊共同作用對抑制微生物生長繁殖和脂質氧化效果更佳。儲藏實驗結果表明，抑菌納米纖維抑菌吸水墊可有效抑制冷卻肉中細菌的生長、降低腐敗優(yōu)勢菌的相對豐度、維持冷卻肉的保水性，還可以延緩冷卻肉TVB-N值、硫代巴比妥酸和pH增加。同時，抑菌納米纖維抑菌吸水墊還具有良好的護色效果，可延緩冷卻肉的氧化變色。其中丁香酚含量為15%時，抑菌納米纖維吸水墊對冷卻肉的保鮮效果最佳。AP-15組相比于無塵紙?zhí)幚斫M可使冷卻肉貯藏期延長3～4 d，相比于空白組可延長冷卻肉貯藏期5～6 d。本實驗以期為將抑菌納米纖維吸水墊應用于冷卻肉貯藏保鮮中，延長冷卻肉貨架期提供一定的理論支撐和技術指導。