裴 斐，韓 萍，王 杰，馬 寧，蘇安祥，楊文建，胡秋輝

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

中國是豬肉生產(chǎn)消費(fèi)大國，獸藥殘留是影響豬肉食品安全的關(guān)鍵。如何提升獸藥殘留檢測(cè)手段、規(guī)范使用獸藥，成為了保證國民食品安全、促進(jìn)我國食品貿(mào)易的關(guān)鍵。其中，獸藥抗生素類藥物具有防治細(xì)菌、真菌感染，提高存活率的作用，常作為飼料添加劑廣泛用于生豬生長養(yǎng)殖[1]。一方面，獸藥抗生素可以通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成或增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，抑制腐敗微生物的生長[2]；另一方面，它可通過阻斷DNA回旋酶和抑制細(xì)菌DNA復(fù)制來實(shí)現(xiàn)抗菌作用[3]。如大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素可通過與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物（tRNA、mRNA）相互作用，來抑制蛋白質(zhì)合成[4]。β-內(nèi)酰胺類抗生素通過阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡。這三類抗生素藥物由于其出色的治理能力，常被作為飼料添加劑促進(jìn)生豬生長養(yǎng)殖。然而，過度使用抗生素會(huì)引起細(xì)菌耐藥性和動(dòng)物體內(nèi)殘留問題。過量的抗生素不僅會(huì)危害人體和生態(tài)環(huán)境，并且農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留過量會(huì)制約中國的出口貿(mào)易[5?6]。因此，建立快速、高效和可信的檢測(cè)抗生物類獸藥殘留方法具有重要意義。

動(dòng)物源性食品存在基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多等特點(diǎn)，目標(biāo)化合物因其理化性質(zhì)差異導(dǎo)致其藥代動(dòng)力學(xué)不同，在動(dòng)物體內(nèi)分布也不同。由于獸藥殘留在樣品中含量極低，國內(nèi)外檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均在向微量化、痕量化發(fā)展，因此樣品前處理技術(shù)是檢測(cè)獸藥殘留的關(guān)鍵。QuEChERS方法是以提取劑、吸水劑和吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理的一種技術(shù)手段。與消除基質(zhì)效果較差和有機(jī)溶劑消耗量大的液液萃取法[7]，易堵塞填料和檢測(cè)成本高的固相萃取法[8?10]以及檢測(cè)時(shí)間長和高含水量樣品回收率較低的基質(zhì)固相分散技術(shù)[11?12]相比，QuEChERS方法省時(shí)、操作簡便、提取效果好。獸藥主要由極性或弱極性的小分子化合物組成，動(dòng)物性食品具有基質(zhì)成分復(fù)雜的特點(diǎn)，因此儀器的高靈敏和高選擇性是獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是獸藥檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)。與精密度差和線性范圍窄的酶聯(lián)免疫法[13?15]、專一性強(qiáng)但無法同時(shí)檢測(cè)多種藥物殘留的分子印記技術(shù)[16]和靈敏度低，抗干擾能力差的高效液相色譜[17?18]相比，超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q-TOF/MS）利用UHPLC的高效分離性和MS檢測(cè)器的高靈敏性、高選擇性相結(jié)合，能夠?qū)ΛF藥殘留進(jìn)行微量、痕量分析[19?22]。朱萬燕等[23]采用QuEChERS結(jié)合UHPLC-Q-TOF/MS的方法，結(jié)果表明該方法簡便、快速、靈敏，適用于豬肉中多類獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。李瑋等[24]采用QuEChERS結(jié)合UHPLC-Q-TOF/MS測(cè)定辣椒中多種禁用著色劑，結(jié)果表明該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和高通量等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于實(shí)際辣椒樣品中多種禁用著色劑的日常檢測(cè)。目前，將QuEChERS樣品前處理方法和UHPLC-Q-TOF/MS快速檢測(cè)方法結(jié)合用于抗生素類獸藥檢測(cè)鮮有相關(guān)報(bào)道。

本文從色譜、質(zhì)譜條件和提取條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立QuEChERS凈化結(jié)合UHPLC-QTOF/MS同步測(cè)定新鮮生豬肉中10種獸藥殘留批量檢測(cè)的分析方法，為今后抗生素類獸藥殘留檢測(cè)方面的研究提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

50份新鮮生豬肉樣品 采購于不同省市市場；甲酸、乙酸、乙酸銨、乙腈、甲醇均為色譜純 德國Merck公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂和乙二胺四乙酸二鈉均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、多點(diǎn)鍵合十八烷基（C18）、C18鍵合鋯膠（Z-SEP+）、佛羅里硅土（Florosil），10種標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：吉他霉素（kitasamycin, KTY）、泰樂霉素（Tylosin, TYL）、四環(huán)素（Tetracycline, TC）、土霉素（Oxytetracycline,OTC）、金霉素（Chlorotetracycline, CHTC）、強(qiáng)力霉素（Doxitard, DOX）、青霉素V（Phenoxymethylpenicillin, PEN-V）、阿莫西林（Amoxicillin, AMO）、氨芐西林（Ampicillin, AMP）、頭孢拉定（Cefradine, RAD） 美國Sigma公司。

Triple TOF 5600+飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB公司；Nexer系列超高效液相色譜儀（包括脫氣機(jī)（DGU-20A5R）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-30AC）、紫外檢測(cè)器（SPDM-20A）、柱溫箱（CTO-30A）及溶液輸送單元（LC-30AD）） 日本島津公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國Agilent公司；Accucore Vanquish C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm） 美國Thermo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；DL-5C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；T18均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；SL1202N型電子天平 上海民橋科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配置成濃度為1000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于?20 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存。根據(jù)需要時(shí)將單標(biāo)儲(chǔ)備液混合配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.2 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制 稱取28.41 g磷酸氫二鈉用水溶解，定容至1000 mL，制成磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）。稱取21.01 g檸檬酸用水溶解，定溶至1000 mL，制成檸檬酸溶液（0.1 mol/L）。將1000 mL檸檬酸溶液（0.1 mol/L）與625 mL磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）混合，加入1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=4，制成Mcllvaine緩沖溶液。稱取62.5 g Na2EDTA于1625 mL Mcllvaine緩沖溶液中均勻混合。

1.2.2 樣品制備 參考郭海霞等[25]的方法并稍作改動(dòng)。取2.00 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后豬肉于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋5 min。隨后加入15 mL 1%甲酸乙腈，渦旋5 min，超聲10 min，10000 r/min低溫冷凍離心5 min。移取上清液至另一離心管，加入2 g NaCl作為鹽析劑和4 g無水Na2SO4作為吸水劑，渦旋5 min，10000 r/min低溫冷凍離心5 min。移取10 mL上清液至50 mL離心管中，加入300 mg C18作為分散劑，重復(fù)上述步驟，取5 mL上清液氮吹至盡干，加入1 mL 0.1%甲酸乙腈-水溶液（1:9，v/v）復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈；初始濃度：5%B；洗脫梯度：0～1 min，5%B；1～6 min，5%B～55%B；6～12 min，55%B～90%B；12～13 min，90%B；13～14 min；90%B～5%B；14～15 min，5%B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 參考朱萬燕等[23]的方法并稍作改動(dòng)。電噴霧離子源（ESI），正離子模式，離子源溫度：550 ℃；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣（GS1）流速：40 μL/min；輔助加熱氣（GS2）流速：40 μL/min；氣簾氣（CUR）流速：20 μL/min；去簇電壓（DP）：100 V；離子富集時(shí)間：0.05 s；掃描范圍m/z：100～1000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件Excel 2016和PeakViewTM軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的篩選 色譜分離優(yōu)化考慮的主要因素有共流出物分離情況和采集時(shí)間。為獲得最佳分離效果及最短分離時(shí)間，比較Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）與Accucore Vanquish C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）。結(jié)果顯示150 mm色譜柱保留時(shí)間較長，分離效果不顯著。同分異構(gòu)體的洗脫分離是色譜條件的優(yōu)化重點(diǎn)，經(jīng)優(yōu)化后的兩組同分異構(gòu)體（四環(huán)素/強(qiáng)力霉素，氨芐西林/頭孢拉定）效果較好，均能達(dá)到基線分離（見圖1）。綜合色譜柱保留時(shí)間和分離效果等因素，最終選用Infinity Lab Poroshell 120 ECC18色譜柱。

圖1 4種抗生素類獸藥的提取離子流圖（Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18柱）Fig.1 Extracted ion chromatogram of four kinds of antibiotic veterinary drugs （Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 column）

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用針泵進(jìn)樣方式分別將1 mol/L單標(biāo)直接進(jìn)樣，在正離子模式下，母離子為[M+H]+，質(zhì)量偏差窗口為3 ppm，時(shí)間偏差為±0.1 min。通過測(cè)定各單標(biāo)精確質(zhì)量數(shù)后，優(yōu)化二級(jí)質(zhì)譜去簇電壓及碰撞能量（表1），使定性定量離子豐度達(dá)到最高。在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜下，分別進(jìn)樣1 mol/L單標(biāo)，以所得數(shù)據(jù)建立篩查譜庫。

表1 10種抗生素類的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters for UHPLC-Q-TOF/MS analysis of the ten antibiotics

PeakViewTM軟件是Q-TOF通過精確質(zhì)量數(shù)及數(shù)據(jù)庫定性篩查識(shí)別目標(biāo)化合物的重要手段[26]。置信因子判斷條件包括質(zhì)量數(shù)誤差、保留時(shí)間誤差、同位素豐度比誤差、譜庫匹配誤差和分子式計(jì)算誤差[27]。為提高篩查準(zhǔn)確性，減少假陽性和假陰性結(jié)果，本研究通過數(shù)據(jù)庫與基質(zhì)加標(biāo)溶液比對(duì)（表2）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證置信因子窗口參數(shù)。結(jié)果表明，10種獸藥均能被正確識(shí)別。

表2 空白樣品中10種抗生素定性篩查結(jié)果Table 2 Qualitative screening results of ten antibiotics in blank samples

2.2 提取條件優(yōu)化

由于豬肉中含有大量脂肪和蛋白質(zhì)，因此減少基質(zhì)干擾是提取溶劑選擇的重點(diǎn)。四環(huán)素類藥物含有四個(gè)并聯(lián)環(huán)，容易與金屬離子如：鈣、鎂離子螯合影響回收率，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)保證在避光、低溫恒溫條件下進(jìn)行，通過加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液可以競爭基質(zhì)中的金屬離子，調(diào)節(jié)緩沖液pH至4.0可以減小四環(huán)素類藥物溶解性，使其能夠更好地被分配至有機(jī)相中，提高提取效率[28]。乙腈作為常用有機(jī)溶劑具有良好的沉淀蛋白能力，提取溶劑的pH會(huì)影響酸堿兩性物質(zhì)的電離[29]。本實(shí)驗(yàn)分別研究了不同酸度乙腈對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖2所示，由于β-內(nèi)酰胺類藥物在酸堿兩性下不穩(wěn)定，極易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，其回收率隨著酸度增加而降低[30]。與此同時(shí)，大環(huán)內(nèi)酯隨著酸度的增加而增加，0.5%甲酸乙腈回收率最高。綜合考慮化合物在不同酸度下的平均回收率，選擇0.1%甲酸乙腈與Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液組合作為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

圖2 不同酸度提取溶劑回收率Fig.2 Recoveries of extraction solvents with different acidities

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)及消除

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)共提物與目標(biāo)分析物競爭電離所產(chǎn)生的影響[31]。本實(shí)驗(yàn)分別配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線（加標(biāo)量：1、5、10、20、50、100 μg/kg），根據(jù)其比值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)當(dāng)比值在0.8～1.2時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)比值大于1.2時(shí)，表明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)比值小于0.8時(shí)，表明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。從表3中可以看出，10種抗生素基質(zhì)效應(yīng)均在0.8～1.2范圍內(nèi)。然而，為了獲得更好的定量效果，本實(shí)驗(yàn)仍使用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來抵消基質(zhì)效應(yīng)[32]。

表3 10種抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Table 3 linear equations, correlation coefficients (r), matrix effect, LODs and LOQs of the 10 antibiotics

2.4 線性度、線性范圍、檢出限和定量限

將豬肉樣品按1.4方法，配制5個(gè)梯度水平（5、10、20、50、100 μg/kg）的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)軸，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)軸做定量工作曲線，得到線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.99031～0.99932，在5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得到檢出限（LOD）為0.25～1.0 μg/kg，10倍信噪比算得定量限（LOQ）為0.5～5.0 μg/kg。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

本實(shí)驗(yàn)在空白豬肉樣品中添加10種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加標(biāo)量：5、10、20 μg/kg），分別進(jìn)行日內(nèi)實(shí)驗(yàn)（重復(fù)6次）和日間實(shí)驗(yàn)（連續(xù)3 d，每天重復(fù)3次）。如表4所示，各化合物回收率72.3%～117.3%，日內(nèi)RSD為0.9%～10.4%，日間RSD為1.1%～13.4%，結(jié)果滿足方法學(xué)要求。

表4 豬肉中10種抗生素的回收率和精密度Table 4 Recovery and RSD for 10 antibiotics spiked into pork

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果，對(duì)采購自不同省市的50份新鮮生豬肉樣品進(jìn)行篩查分析，結(jié)果顯示有1份豬肉樣品中四環(huán)素呈陽性，含量為75.4±1.8 μg/kg。同時(shí)采用國標(biāo)GB/T 21317-2007進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果為77.8±2.3 μg/kg，經(jīng)t檢驗(yàn)法分析，P>0.05，兩種方法所測(cè)結(jié)果無顯著性差異，表明本方法可以作為豬肉中抗生素類獸藥殘留的定性定量測(cè)定。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS凈化結(jié)合UHPLC-QTOF/MS法同時(shí)篩查豬肉中10種抗生素類獸藥殘留量的分析方法。采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液-0.1%甲酸乙腈-NaCl-無水Na2SO4-C18的提取凈化組合，通過Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱對(duì)10種抗生素類獸藥進(jìn)行分離，并利用高分辨質(zhì)譜建立了篩查譜庫，縮小了確證誤差。從方法學(xué)驗(yàn)證所得結(jié)果來看，本方法基質(zhì)效應(yīng)為0.80～1.15，相關(guān)系數(shù)r為0.99031～0.99932，LOD為0.25～1.0 μg/kg，LOQ為0.5～5.0 μg/kg。在不同加標(biāo)濃度下，平均回收率為72.3%～117.3%，日內(nèi)RSD為0.9%～10.4%，日間RSD為1.1%～13.4%。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)相比，本方法對(duì)于實(shí)際陽性樣品檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)相近，且操作簡便縮短檢測(cè)時(shí)間，準(zhǔn)確度與精密度均滿足方法學(xué)要求，為抗生素類獸藥殘留檢測(cè)提供了切實(shí)有效的篩查方法，也為食品安全提供了技術(shù)保障。同時(shí)也為其他動(dòng)物源性食品中抗生素類獸藥殘留的檢測(cè)提供方法參考，以期實(shí)現(xiàn)在待測(cè)樣品物理化性質(zhì)差異較大的條件下快速篩查和測(cè)定。