李澤林，王秋婷，郭其洪，桂海佳，谷大海，王雪峰，肖智超，王桂瑛，范江平

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

我國(guó)是雞肉等禽肉生產(chǎn)大國(guó)，2020年肉雞總產(chǎn)量約為1485萬(wàn)噸，是四大肉雞主產(chǎn)國(guó)之一，肉雞在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)品，其中雞骨就是主要副產(chǎn)物之一[1]。雞骨中含有豐富的蛋白質(zhì)（含量可達(dá)16.3%與等量雞肉相似）、脂肪、礦物質(zhì)、氨基酸、軟骨素、酸性黏多糖和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)素，比例均衡、生物價(jià)高，是優(yōu)質(zhì)的蛋白源[2?3]；目前，有少部分雞骨被制作成雞骨泥或粉添加到食品中，有部分被用來(lái)制作明膠、提取雞骨素和蛋白水解物等[4]；雞骨被水解后會(huì)釋放大量的呈味游離氨基酸，還會(huì)產(chǎn)生和諧的香氣，具有良好的制作調(diào)味料基料的潛質(zhì)；但是，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道雞骨酶解前后關(guān)鍵的風(fēng)味化合物，因此探明雞骨關(guān)鍵呈味游離氨基酸和關(guān)鍵香氣化合物有助于推動(dòng)以雞骨為基料的食品風(fēng)味機(jī)制的探究。

味覺活性值[5]（taste activity value，TAV）和香氣活性值[6]（odor activity value，OAV）是評(píng)價(jià)食品中化合物對(duì)滋味和香氣貢獻(xiàn)大小的重要量化指標(biāo)；前者可以評(píng)價(jià)化合物，如游離氨基酸對(duì)食品酸、甜、苦、咸、鮮滋味的貢獻(xiàn)度，后者則可以評(píng)估揮發(fā)性化合對(duì)食品香氣輪廓的貢獻(xiàn)[7]。目前，TAV和OAV已被廣泛應(yīng)用到食品領(lǐng)域，用來(lái)評(píng)估分析食品成分對(duì)滋氣味的影響。張曼等[8]結(jié)合TAV和OAV篩選發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的鮮辣椒沒有特征凸出的呈味氨基酸，有17種關(guān)鍵香氣成分（OAV>1），其中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、乙酸己酯、α-合金歡烯是構(gòu)成鲊?yán)苯凤L(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)。孫圳等[9]在鹵制雞肉中發(fā)現(xiàn)正辛醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和芳樟醇OAV>1，并確定這些化合物為鹵制雞肉的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

因此，為了探究雞骨液酶解前后游離氨基酸及揮發(fā)性香氣成分的變化情況，本研究擬展開雞骨液酶解工藝優(yōu)化研究，并分析酶解前后的游離氨基酸及揮發(fā)性成分，以篩選出對(duì)其滋味和香氣有關(guān)鍵貢獻(xiàn)的游離氨基酸和揮發(fā)性香氣化合物。旨在為雞骨的綜合利用以及其風(fēng)味的深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白羽肉雞全骨（干凈剔除雞身所有肉、油、皮和筋） 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)雞場(chǎng)提供；動(dòng)物蛋白水解酶（食品級(jí)，4萬(wàn)U/g）、風(fēng)味蛋白酶（食品級(jí)，5萬(wàn)U/g） 浙江一諾生物科技有限公司；C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；硫酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

PL303型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C型雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；S-433型氨基酸自動(dòng)分析儀 德國(guó)sykam公司；SCION SQ 456-GC型氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)力可有限公司；DB-WAX型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；PG-150型碎骨機(jī) 諸城市廣優(yōu)機(jī)械科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨液酶解工藝 取雞骨→碎骨機(jī)破碎（過(guò)60目篩）→加水混勻→調(diào)節(jié)pH→加入酶→水浴酶解→滅酶→離心→取上清液備用。

操作要點(diǎn)：雞骨勻漿液先調(diào)整pH到7使其達(dá)到動(dòng)物蛋白酶與風(fēng)味酶最適値，再加入酶（兩者比例1:1，w/w）；待酶解完成后，酶解液沸水浴滅酶10 min；最后在4000 r/min條件下離心15 min。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)樣品水解度的影響 以水解度為指標(biāo)，固定料液比1:3 g/mL、酶解溫度50 ℃、復(fù)合酶添加量0.5%，探討不同酶解時(shí)間（3、4、5、6 h）下樣品水解度的大小。

1.2.2.2 酶解溫度對(duì)樣品水解度的影響 以水解度為指標(biāo)，固定酶解時(shí)間5 h、料液比1:3 g/mL、復(fù)合酶添加量0.5%，探討不同酶解溫度（45、50、55、60 ℃）下樣品水解度的大小。

1.2.2.3 料液比對(duì)樣品水解度的影響 以水解度為指標(biāo)，固定酶解時(shí)間5 h、酶解溫度50 ℃、復(fù)合酶添加量0.5%，探討不同料液比（1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL）下樣品水解度的大小。

1.2.2.4 酶添加量對(duì)樣品水解度的影響 以水解度為指標(biāo)，固定酶解時(shí)間5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:3 g/mL，探討不同復(fù)合酶添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）下樣品水解度的大小。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定酶解溫度50 ℃進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor level design of response surface test

1.2.4 水解度測(cè)定 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.235《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定；總氮的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.5《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定。按照公式（1）計(jì)算水解度：

1.2.5 游離氨基酸測(cè)定 取酶解前后的雞骨液進(jìn)行游離氨基酸的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.124《食品中氨基酸的測(cè)定》的方法使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 味覺活性值計(jì)算 參考Zhang等[10]的方法，利用味覺活性值（taste activity value，TAV）評(píng)價(jià)各呈味氨基酸對(duì)雞骨液滋味的影響。按以下公式（2）計(jì)算TAV：

1.2.7 揮發(fā)性成分的GC-MS檢測(cè) 樣品處理：取酶解前后雞骨液樣品6 mL于頂空瓶（20 mL）中，插入萃取頭萃取30 min（60 ℃）后取出，再插入氣相色譜進(jìn)樣口解吸3 min（250 ℃）。GC條件：色譜柱：DBWAX石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱流量：恒流的模式進(jìn)樣（0.8 mL/min）；載氣：高純度氦氣；起始溫度40 ℃（3 min），第一階段5 ℃/min升至90 ℃，第二階段10 ℃/min升至250 ℃（6 min）；進(jìn)樣口的溫度為250 ℃。MS條件：離子源：EI；離子源溫度200 ℃；電壓70 eV；色譜-質(zhì)譜接口溫度250 ℃。

揮發(fā)性化合物定性：將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，并與NIST 14的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。保留指數(shù)（RI）的計(jì)算方法如下：以標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和相同色譜條件下C7～C30正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算檢測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)（RI）。定量：對(duì)揮發(fā)性化合物定量時(shí)添加3-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，以內(nèi)標(biāo)物的峰面積與氣味活性化合物的峰面積比值計(jì)算各物質(zhì)的含量。

1.2.8 香氣活性值計(jì)算 參考Yang等[11]的方法，利用香氣活性值（odor activity value，OAV）評(píng)價(jià)各揮發(fā)性化合物對(duì)雞骨液酶解前后香氣輪廓的影響。按以下公式（3）計(jì)算OAV：

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)三次取平均數(shù)，使用設(shè)計(jì)專家設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，Excel 2016制作雷達(dá)圖及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對(duì)水解度的影響 由圖1a可知，當(dāng)酶解溫度在45～50 ℃時(shí)，水解度隨著溫度升高而增加，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，水解度最大32.46%±0.68%。當(dāng)酶解溫度高于50 ℃時(shí)水解度隨著溫度的升高而下降，原因是溫度過(guò)高引起蛋白質(zhì)分子過(guò)度聚合，酶的活力受到影響，酶蛋白變性，水解度隨之降低。因此，50 ℃為最優(yōu)酶解溫度。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖1b可知，酶解3～5 h時(shí)水解度逐漸增大，酶解5 h時(shí)水解度最高33.79%±0.84%，酶解時(shí)間繼續(xù)增加化學(xué)反應(yīng)平衡后，反應(yīng)向反方向進(jìn)行，水解度降低。因此，5 h為最優(yōu)酶解時(shí)間。

2.1.3 酶添加量對(duì)水解度的影響 由圖1c可知，隨著酶添加量的增加、酶活增大，水解度增高，當(dāng)酶添加量為0.6%時(shí)，水解度最大33.72%±0.48%，當(dāng)超過(guò)0.6%時(shí)水解度下降。因此，酶添加量0.6%為最優(yōu)值。

2.1.4 料液比對(duì)水解度的影響 由圖1d可知，隨著料液比的減小，雞骨的水解度呈先增大后減小的趨勢(shì)，在料液比為1:3 g/mL時(shí)，雞骨的水解度最大為32.7%±1.07%。料液比決定了酶解底物的濃度，在1:2 g/mL時(shí)因底物的濃度過(guò)高，影響了反應(yīng)的化學(xué)平衡導(dǎo)致水解度低；當(dāng)料液比超過(guò)1:3 g/mL時(shí)，反應(yīng)底物的濃度過(guò)低，化學(xué)反應(yīng)變慢，導(dǎo)致水解度下降。因此，1:3 g/mL為最佳料液比。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在溫度50 ℃、復(fù)合酶比例1:1條件下，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酶解雞骨液工藝進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=33.15+1.68A+1.23B+1.59C?1.92AB?2.07AC?0.90BC?2.08A2?2.38B2?1.39C2

根據(jù)表3，對(duì)回歸模型方差進(jìn)行分析。模型P<0.01，失擬項(xiàng)P=0.2940>0.05，說(shuō)明模型顯著具有可行性。模型的決定系數(shù)R2=0.9604，R2Adj=0.9094，兩者相差較小，說(shuō)明此模型可用于分析酶解雞骨的工藝優(yōu)化。模型中，一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB和AC，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)水解度的影響極顯著（P<0.01），根據(jù)F值可以得出因素對(duì)水解度的影響順序依次為酶解時(shí)間>料液比>酶添加量。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression model analysis of variance and model significance test

2.3 交互作用分析及模型驗(yàn)證

響應(yīng)曲面圖與等高線圖可以反映兩個(gè)變量之間的交互類型以及各因素對(duì)水解度影響的顯著性。由圖2a～c可知，隨著因素的增大，水解度先增大后下降，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。圖2a～b的等高線圖屬于橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著，而圖2c的等高線圖接近圓形，說(shuō)明交互作用不顯著，這與方差分析表中的結(jié)果相一致。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of interaction of various factors

通過(guò)模型得到的最優(yōu)結(jié)果為：時(shí)間5.1 h、酶添加量0.61%、料液比1:3 g/mL，水解度為33.68%±1.53%。根據(jù)此工藝條件進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，并計(jì)算其水解度的平均值為33.24%±0.61%，與理論值相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明該工藝具有可行性。

2.4 酶解對(duì)雞骨液游離氨基酸含量及味覺活性值的影響

雞骨中的蛋白質(zhì)有90%以上屬于結(jié)構(gòu)性的膠原蛋白、呈纖維狀，其含量占機(jī)體總蛋白的25%～30%[12]，這些蛋白被酶解后可添加到風(fēng)味基料和調(diào)味料中以增強(qiáng)其風(fēng)味的豐富度及層次感。由表4可知，雞骨酶解前游離氨基酸含量較低，呈甜味的氨基酸總含量最高僅為535.37 mg/kg，酶解后17種游離氨基酸含量均極顯著（P<0.01）增加，以苦味氨基酸增幅最大總含量達(dá)到了9776.58 mg/kg，相比酶解前增加了27.9倍，與丁小燕等[13]研究的雙酶水解雞骨泥結(jié)果一致。雖然苦味氨基酸在酶解后極顯著（P<0.01）增加，但苦味氨基酸不具備味覺活性，且其苦味易被其他呈味氨基酸的味道掩蓋[14]。此外，呈甜味的精氨酸與呈鮮味的谷氨酸協(xié)同作用下可以呈現(xiàn)令人愉快的味道，也可以掩蓋大部分苦味。所以，雞骨酶解液滋味主要以鮮味和甜味為主。

表4 雞骨液酶解前后游離氨基酸含量、閾值、呈味特性及TAV值Table 4 Contents, thresholds in water, taste contribution and TVA value of free amino acids in chicken bone homogenate before and after enzymolysis

當(dāng)TAV值大于1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)具有強(qiáng)烈的滋味活性，對(duì)食物的整體滋味輪廓貢獻(xiàn)大，且TAV的大小和其對(duì)滋味貢獻(xiàn)成正比[15]。本研究酶解前游離氨基酸的TAV只有谷氨酸（8.76）、丙氨酸（2.65）、纈氨酸（1.43）和賴氨酸（5.56）大于1，酶解后所有檢測(cè)到的游離氨基酸TAV均大于1。其中，天門冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、纈氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、異亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和賴氨酸（81.99）的TAV均大于10遠(yuǎn)大于1，對(duì)其整體風(fēng)味貢獻(xiàn)極強(qiáng)。

2.5 酶解前后雞骨液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

續(xù)表 4

續(xù)表 5

續(xù)表 5

采用HS-SPME-GC-MS對(duì)酶解前后的雞骨液檢測(cè)，結(jié)果如表5所示，共檢測(cè)出揮發(fā)性化合物92種，酶解前63種，酶解后66種，其中包含了27個(gè)醇、10個(gè)酮、9個(gè)酸、7個(gè)酯、15個(gè)烴類、1個(gè)酚、3個(gè)雜環(huán)和20個(gè)醛類。這些化合物構(gòu)成了雞骨酶解前后的揮發(fā)性風(fēng)味輪廓，醇和酸類相對(duì)含量在酶解后增加，醛類、烴類和酮類減少，說(shuō)明這些化合物含量的變化使酶解前后雞骨液揮發(fā)性組成成分以及其對(duì)香氣的貢獻(xiàn)有所差別。

表5 雞骨液酶解前后揮發(fā)性成分比較Table 5 Comparison of volatile components of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

醇和酸主要是賦予食物芳香、花香、甜味、水果味、酸味和蘑菇味的主要來(lái)源，酸可以由氨基酸降解后經(jīng)氧化或還原作用產(chǎn)生，也可能由飽和脂肪酸本身氧化降解產(chǎn)生，是酯類化合物合成的前體物質(zhì)[16?18]。本研究中，酶解后辛醇、1,2-庚二醇、芳樟醇、薄荷醇和庚酸、壬酸、戊酸等對(duì)花香、香甜、酸香和水果香有貢獻(xiàn)的化合物含量增加。烴類化合物可能是由脂質(zhì)自氧化產(chǎn)生，且大部分烴類物質(zhì)被報(bào)道香氣較弱或無(wú)氣味[19]；醛類也可以由食物中脂肪酸的氧化和蛋白質(zhì)的Strecker降解反應(yīng)而生成且氣味閾值較低[20]，與酮類等揮發(fā)性化合物具有麥芽味、青草味、甜味、烤面包香、焦糖香和咖啡香等[21?22]。本研究中，1-辛烯-3-酮、5-甲基-3-庚酮、甲基庚烯酮和正戊醛、己醛、壬醛、苯甲醛等在酶解后消失或者含量降低會(huì)造成香氣的減弱，但反式-2-癸烯醛、十四醛、庚醛和十六醛等的增加會(huì)減少青草味等不愉快的氣味。此外，酶解后2-戊基呋喃、2-乙基呋喃和2-正丁基呋喃含量的增加會(huì)增強(qiáng)雞骨液的烤香味。

2.6 雞骨液關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分及其香氣輪廓分析

OAV是將GC-MS所測(cè)定的揮發(fā)性化合物濃度與每種揮發(fā)性化合物對(duì)應(yīng)的嗅覺閾值相結(jié)合分析，可有效地評(píng)估每一個(gè)揮發(fā)性成分對(duì)樣品香氣輪廓的貢獻(xiàn)大小[23]。化合物的OAV大于或等于1說(shuō)明該揮發(fā)性成分能被感官察覺且對(duì)雞骨的整體香氣貢獻(xiàn)較大。

由表6可知，雞骨液酶解前后OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)共有17種，其中酶解前13種、酶解后16種，包括醇類4種、酯類2種、呋喃類2種、醛類9種，酶解后OAV≥1的揮發(fā)性化合物增加，香氣輪廓更加豐富。與上述結(jié)果一致，低閾值的醛類對(duì)香氣是貢獻(xiàn)最大的，其OAV也大。酶解后雞骨液中己醛（OAV：147.51）、辛醛（OAV：232.33）、壬醛（OAV：16.89）、苯甲醛（OAV：5.17）、反,反-2,4-癸二烯醛（OAV：706.33）、1-辛烯-3-醇（OAV：346.67）、庚醇（OAV：3.25）、己酸乙酯（OAV：0.54）的含量及OAV下降，降低了揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生的花香、果香以及蠟味等香氣，但是芳樟醇（OAV：2.29）、正壬醇（OAV：16.82）、2-戊基呋喃（OAV：59.49）、2-正丁基呋喃（OAV：1.11）、2-辛烯醛（OAV：160.45）、反式-2-癸烯醛（OAV：180.97）、庚醛（OAV：3.95）的含量及OAV上升，增加了瓜香、肉香、烘烤香、動(dòng)物油脂味，使整體風(fēng)味更加和諧。

表6 雞骨液酶解前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAVTable 6 OAV of volatile flavor compounds of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

雞骨液酶解前后的揮發(fā)性香氣包含了水果香、花香、脂肪香、瓜香、草味、烘烤香、肉香、蘑菇、檸檬味和綠豆味。根據(jù)香氣化合物的風(fēng)味特征，以及參照香氣輪中的模塊分類可以將計(jì)算得到OAV≥1的各香氣化合物繪制香氣輪廓圖[30]。如圖3所示，酶解后香氣輪廓比酶解前小，特別酶解前呈脂肪味的揮發(fā)性組分總OAV達(dá)到了2415.38，使雞骨液的脂肪味過(guò)于凸出，而掩蓋其它化合物的香氣，但是酶解后下降到了1081.48，相比于與酶解前減小了2.23倍，很大程度的降低了脂肪味；雖然酶解會(huì)降低呈花香、果香果香的化合物濃度，但是增加了呈烘烤、綠豆、瓜香和肉香化合物的濃度，從而讓雞骨酶解液香氣更豐富，接受度會(huì)更高，與鄭曉杰等[31]的研究結(jié)果相似。

圖3 雞骨液酶解前后風(fēng)味輪廓Fig.3 Flavor profile of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

雞骨是肉雞加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要可利用副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸等，具有較好的開發(fā)價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，共有13個(gè)游離氨基酸的TAV大于1，其中天門冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、纈氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、異亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和賴氨酸（81.99）大于10，對(duì)雞骨液滋味貢獻(xiàn)極大。共鑒定出揮發(fā)性化合物92種，酶解前63種，酶解后66種，其中OAV≥1酶解前13種、酶解后16種，包括醇類4種、酯類2種、呋喃類2種、醛類，酶解前雞骨液有強(qiáng)烈的脂肪味，酶解后脂肪味減弱其OAV降低了2.23倍，同時(shí)花香、果香香氣貢獻(xiàn)減低，但是增加了烘烤、綠豆、瓜香和肉香的貢獻(xiàn)?？蔀榻窈箅u骨酶解風(fēng)味的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，但是為了更準(zhǔn)確的對(duì)其香氣輪廓的表征，在后續(xù)的研究中可以增加嗅聞、香氣缺失和香氣重組等試驗(yàn)。