馮萬有，楊燕燕，蒙麗娜，陳 春，何立珍，鄧 凱，楊小芬，覃廣勝，石德順，*

(1.南寧師范大學(xué)環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室；3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組不編碼蛋白質(zhì)、長度22～25 nt內(nèi)源性單鏈RNA，通過與mRNA的3'UTR堿基互補配對調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。多項研究表明，miRNAs在哺乳動物基因表達網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用，而轉(zhuǎn)錄miRNA基因的突變顯著影響卵母細胞發(fā)育、癌細胞增殖、干細胞分化和DNA損傷修復(fù)等。miRNA的基因或部分基因的內(nèi)含子首先被RNA轉(zhuǎn)錄酶II轉(zhuǎn)錄形成初級miRNA(pri-miRNA)，隨后在核中被Drosha-DGCR8處理成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA與exportin-5蛋白結(jié)合，被運送至胞質(zhì)中，經(jīng)Dicer酶處理后形成成熟的miRNA雙鏈，隨后與Argonaute蛋白結(jié)合(也被稱作Ago)形成RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。miRNA的一條鏈保存在RISC中，另一條鏈則被剔除RISC后迅速降解。關(guān)于兩條鏈在RISC中如何分開，如何剔除還有待研究。miRNA-Ago復(fù)合物是RISC的作用中樞,通過miRNA與靶mRNA 3非編碼區(qū)特異結(jié)合，指導(dǎo)RISC復(fù)合體下調(diào)靶基因表達。miRNA 5'端的6-8個核苷酸序列是miRNA和靶mRNA3'UTR結(jié)合的關(guān)鍵位點，因此稱為“種子”序列。(圖1A)

為了更好理解miRNAs的生物學(xué)和病理學(xué)意義，近年來開發(fā)了諸多技術(shù)，但基本受限于低效率和靶向特異性，如miRNA模擬物——化學(xué)合成的寡核苷酸，用于獲得性功能驗證試驗，但其可能會擾亂內(nèi)源miRNA通路。合成的與miRNA互補的寡核苷酸能可抑制miRNA的功能，但不可忽略的是靶向特異性。miRNA海綿技術(shù)，一個能有效專一性結(jié)合miRNA的新興技術(shù)，也受到靶向特異性的制約。因此通過敲除miRNA種子序列或發(fā)夾結(jié)構(gòu)方式將會是一個理想的選擇。雖然基于傳統(tǒng)同源重組的基因敲除方法已被用來在動物模型中敲除miRNA，但由于低效率(10-9-10-6/cell)，該方法很難被廣泛應(yīng)用。

目前的基因組編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(ZFN),轉(zhuǎn)錄激活樣元件核酸酶(TALEN)和來自微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)CRISPR的RNA介導(dǎo)的cas9內(nèi)切酶(CRISPR/cas9)、Cas12等。相比ZFNs和TALENs基于蛋白質(zhì)-DNA的互用定位，CRISPR/cas9通過導(dǎo)向RNA靶向目標(biāo)基因的操作更加便捷、特異性更強。此外，基于多條gRNA靶向不同基因位點可實現(xiàn)多基因同時敲除。首例利用CRISPR/cas9開展基因工程研究后，目前已發(fā)表了一系列關(guān)于CRISPR/cas9在多種真核生物的應(yīng)用，但是這些研究更多的集中于蛋白質(zhì)編碼基因。本研究中，我們的闡明使用CRISPR/cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)能高效敲除miRNA基因的種子或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，為探究目標(biāo)miRNA的生物學(xué)功能提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

人源化的cas9載體購買于Addgene(hCas9, Plasmid #41815)。gRNA載體中的U6啟動子序列來自pSico載體(Addgene)，將其克隆到pEASY-T1載體(Transgene)，命名為pEasy-T1-U6(圖1B)。通過在線gRNA設(shè)計篩選網(wǎng)站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)完成gRNA的設(shè)計，其寡核苷酸序列送至生工生物工程股份有限公司(上海)合成(表1)，隨后將其接連到以構(gòu)建好的pEasy-T1-U6載體上。gRNA活性報告載體RGS(Jin-Soo Kim lab)是借鑒Hwang等人的研究方法，將合成的gRNA核苷酸互補鏈克隆到RGS載體上，表2是用到的相應(yīng)寡核苷酸序列，其中值得提出的是這些寡核苷酸序列需包含5'-NGG-3'序列。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將HEK293T細胞接種在添加10%的胎牛血清，2 mm谷氨酰胺(Life Technologies)，100 IU/mL的青霉素和100 μg/μL鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Life Technologies)中，37℃×5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照Lipofectamine 2000(invitrogen, USA)的操作說明轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。

1.3 流式細胞分析

用PBS懸浮轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后使用BD C6流式細胞儀進行分析(BD Biosciences, USA)，收集共轉(zhuǎn)gRNA、Cas9和RGS報告載體后的細胞，陰性對照為共轉(zhuǎn)Cas9和RGS報告載體的細胞，單陽組分別為僅轉(zhuǎn)染RGS(僅表達紅色熒光)和eGFP-N1(表達綠色熒光)，每組實驗重復(fù)三次。

1.4 T7E1試驗

按照血液組織基因組試劑盒(QIAgen，Cat No.69504)的操作說明書提取轉(zhuǎn)染后的HEK293T細胞基因組DNA，隨后通過特異引物擴增出含有靶向編輯目標(biāo)基因的序列，PCR程序是①94℃ 5min；②94℃30s，60℃30s，72℃ 40s，共35個循環(huán)；③72℃ 2 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物煮沸10 min，在室溫環(huán)境中緩慢冷卻，形成異源雙鏈DNA，37℃下T7EI(New England Biolabs)酶切1.5 h后，2%瓊脂糖凝膠(Takara)電泳分析。

1.5 目標(biāo)基因突變分析

按PMD18-T TA克隆試劑盒(TaKaRa，Cat No.D101A)說明書，鏈接PCR產(chǎn)物后將其轉(zhuǎn)化到本實驗室制備好的DH5α大腸桿菌感受態(tài)，37℃過夜培養(yǎng)后挑選單克隆菌株送至測序(BGI, Guangzhou)。分析等位基因與野生型等位基因是否發(fā)生突變，統(tǒng)計分析突變率(突變菌落數(shù)/挑選總菌落數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向miRNA的gRNA篩選與檢測

miRNA敲除的難點在于miRNA序列的簡短性和多樣性。由于種子序列是關(guān)鍵功能區(qū)，而發(fā)夾結(jié)構(gòu)又在Drosha核酸酶切割pri-miRNAs過程中起關(guān)鍵性作用，為了能夠有效地敲除miRNA基因，因此選擇miRNA的種子序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)為gRNA位點(圖1A，表 1)。為了檢測gRNA的活性，我們首先使用帶有mRFP基因，gRNA序列和移碼的eGFP基因的報告載體(圖1C，表2)，其工作原理是在不發(fā)生切割時，因為eGFP基因前存在終止密碼子，轉(zhuǎn)染細胞后僅表達mRFP。反之，若CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能，依靠細胞內(nèi)DNA損傷后NHEJ修復(fù)機制，隨機插入或缺失導(dǎo)eGFP基因前段的終止密碼子移碼突變，eGFP恢復(fù)表達。

按gRNA∶Cas9∶RGS=1∶1∶0.5比例轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HEK293T細胞，48 h后觀察發(fā)現(xiàn)大部分細胞表達mRFP，部分細胞表達eGFP，在未轉(zhuǎn)染gRNA的細胞中，未見或極少見eGFP的表達(圖2),表明篩選的gRNA能夠有效地發(fā)揮靶向功能。選取活性高的gRNA2-miRNA-182和gRNA2-miRNA-155，分別與cas9載體按不同的比例轉(zhuǎn)染后不同觀察發(fā)現(xiàn)，表達eGFP的細胞數(shù)量存在差異(圖3)，流失細胞統(tǒng)計分析表明表達eGFP的細胞數(shù)量存在顯著差異(圖4)。

圖2 報告載體RGS與hCas9、gRNA的載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，RFP和GFP的表達

圖3 將gRNA與hCas9按不同劑量比列轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察

2.2 流式細胞儀分析gRNA活性

酶的特異性和活性對反應(yīng)條件具有顯著的依賴性，酶量過大會顯著增加脫靶率。限制酶用量，即減少Cas9-gRNA復(fù)合物量，是減少細胞非特異性敲除潛在策略。檢測報告載體雙熒光同時表達的HEK293T細胞，發(fā)現(xiàn)gRNA與Cas9的比值在2∶1到1∶16時，eGFP都有表達，然而我們發(fā)現(xiàn)gRNA2-miRNA-182:Cas9的比值為1∶4時，表達eGFP的細胞增加4倍，當(dāng)gRNA2-miRNA-155 : Cas9 的比值為1∶4時，表達eGFP的細胞增加了28倍(圖4)。因此結(jié)果可能表明，在人類細胞中g(shù)RNA的表達量可能是目標(biāo)基因靶向編輯的限制性因素。

圖4 流式細胞統(tǒng)計分析gRNA與hCas9按不同劑量比列轉(zhuǎn)染后，eGFP表達效率

HEK293T細胞分別用編碼hCas9的報告載體和以及靶向miRNA-182和miRNA-155基因的gRNA載體共轉(zhuǎn)染，48h后熒光顯微鏡觀察。未轉(zhuǎn)染的gRNA細胞作為陰性對照。比例尺= 100μm。

分別統(tǒng)計每組表達紅色熒光(RFP)和綠色熒光(eGFP)的細胞數(shù)量，然后計算eGFP/RFP的比值來確定不同轉(zhuǎn)染比列對目標(biāo)基因編輯的影響。

2.3 miRNA-182和miRNA-155的敲除

接下來，我們用篩選出來的gRNA敲除人miRNA-182和miRNA-155。按照gRNA∶Cas9=1∶4的轉(zhuǎn)染劑量轉(zhuǎn)染HEK293T細胞48 h，提取基因組DNA后經(jīng)特異性引物(表3)擴增目標(biāo)DNA片段，T7EI核酸內(nèi)切酶驗證發(fā)現(xiàn)每對gRNA都能夠引起miRNA的突變(圖5)。通過TA克隆測序驗證突變類型，以及突變率，發(fā)現(xiàn)突變率在14.3%～20%之間，大多數(shù)的突變?yōu)槎唐?<10bp)的缺失和插入，少數(shù)在斷裂部分出現(xiàn)缺失和插入共存現(xiàn)象(圖6)。

表3 PCR擴增目標(biāo)基因時所需的引物序列

圖5A 圖5B

A圖中條帶1，2分別代表的是gRNA1-miRNA182，gRNA2-miRNA182；B圖中條帶1，2分別代表的是gRNA1-miRNA155，gRNA2-miRNA155；圖中M帶表的是DNA marker。

圖6A

圖6B

3 討論

我們旨在探究是否可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向人類細胞中的miRNA。人類基因組中大約有20 000個蛋白質(zhì)編碼基因，約占全基因組的2.0%～2.5%，其余是包括miRNA在內(nèi)的非編碼RNAs。miRNA基因不像由成百上千個核苷酸組成的編碼蛋白質(zhì)基因那么典型，其基因序列因為相對簡短，從而找到最佳的gRNA結(jié)合位點受到一定限制。我們的研究結(jié)果指出，能夠利用CRISPR/Cas9技術(shù)特異高效的敲除miRNA種子序列或發(fā)夾序列，從而實現(xiàn)其突變。因為種子序列和發(fā)夾序列是抑制基因表達的關(guān)鍵區(qū)域，可成為候選敲除miRNAs的區(qū)域。我們也發(fā)現(xiàn)gRNA的活性可能是與目標(biāo)基因的結(jié)合位點有關(guān)，這也表明，盡管我們遵循設(shè)計指南，但也存在其他因素影響CRISPR/Cas9技術(shù)的敲除效率，例如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA修飾(如甲基化)，或其他DNA序列變異都是影響gRNA結(jié)合的因素。因為當(dāng)前也實現(xiàn)是轉(zhuǎn)染多條gRNA同時敲除多個目標(biāo)基因或大片段刪除感興趣的基因。因此，結(jié)合當(dāng)前的研究結(jié)果以及我們的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是實現(xiàn)靶向miRNA基因敲除的優(yōu)異技術(shù)，在研究miRNA調(diào)控動物卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟、顆粒細胞增殖方面有一定的潛力。