孫嘉嚀 王志悅 王許剛 李獻(xiàn)華 徐明舉 徐彤*

（1，河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 075000；2，河北省張家口市萬全區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 075000）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的、主要對豬群生長發(fā)育帶來嚴(yán)重危害的細(xì)菌性傳染疾病，一年四季均可發(fā)生[1]。該病可導(dǎo)致豬場死淘率明顯提高，使生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益下降。該病主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、食欲減退、咳嗽、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、步態(tài)僵硬和共濟(jì)失調(diào)。病豬和帶菌豬是該病的傳染源，由受污染的空氣經(jīng)呼吸道、消化道和破損的皮膚傳播。當(dāng)豬抵抗力下降或受到應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，潛伏的細(xì)菌將在體內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致該病發(fā)生。

1 發(fā)病情況

2020 年7 月某規(guī)?；B(yǎng)豬場保育豬陸續(xù)出現(xiàn)一種以被毛粗亂，體溫升高可達(dá)41℃，食欲減退、呼吸困難、腹式呼吸、共濟(jì)失調(diào)為特征的疫病。部分病豬走路緩慢，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，雙側(cè)或單側(cè)肢體不平衡，關(guān)節(jié)腫脹；四肢和耳朵發(fā)紺，為藍(lán)紫色；臀部及腹下皮膚出現(xiàn)紫紅色斑塊。期間約70 多頭發(fā)病豬出現(xiàn)死亡，病死率約為80%。

2 臨床剖檢

病理剖檢以漿液性、纖維素性滲出為特征，喉管內(nèi)有大量黏液；胸腔內(nèi)有較多淡黃色或紅色積液，胸膜脂肪輕度黃染；肺臟水腫淤血，表面有大量出血斑點(diǎn)、部分區(qū)域呈現(xiàn)實(shí)變；肝臟變性出血；脾腫大、質(zhì)地柔軟且邊緣增厚，有大小不等的梗死灶；心包積液、有纖維素滲出，呈現(xiàn)“絨毛心”；腎有出血點(diǎn)；膝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)腫脹，有波動感，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有漿液性纖維蛋白滲出物。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 豬瘟、圓環(huán)和繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)定量PCR 檢測

為確定是否有豬瘟病毒、圓環(huán)病毒及繁殖與呼吸綜合征病毒感染，無菌采取6 頭病死豬的脾臟、肺臟、腎臟及淋巴結(jié)樣本共19 個(gè)，按照病毒DNA/RNA 提取與純化試劑盒說明書提取所需核酸。根據(jù)湖南國測生物科技有限公司生產(chǎn)的豬瘟病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測試劑盒、繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測試劑盒、圓環(huán)病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

3.2 細(xì)菌檢測

3.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

從上述病料釣菌劃線接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基和含5%無菌胎牛血清及過濾除菌的1%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的TSA 固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24h 后進(jìn)行觀察。

3.2.2 染色鏡檢

挑取典型、單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

3.2.3 生化鑒定

挑單個(gè)菌落接種到過氧化酶、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、木糖、尿素、蛋白胨水生化反應(yīng)試劑管中，37 ℃、24h 培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

3.3 小鼠致病性試驗(yàn)

將8 只SPF、C57B 小鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。用生理鹽水洗下含NAD 的TSA 瓊脂培養(yǎng)基上分離純化的細(xì)菌，將菌液稀釋成1.0×109CFU/ml，每只鼠0.2ml 的劑量注射到小鼠腹腔內(nèi)，對照組采用相同劑量和途徑注射滅菌的生理鹽水，觀察臨床表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)死亡率。

3.4 藥敏試驗(yàn)

挑取純化后的分離菌，用涂布棒均勻接種在含有NAD 的TSA 培養(yǎng)基平板上，采用藥敏片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。37 ℃、24h 后觀察結(jié)果。

4 結(jié)果

4.1 豬瘟、圓環(huán)和繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)定量PCR 檢測結(jié)果

上述病料經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測結(jié)果顯示，內(nèi)參、陽性及陰性對照均符合標(biāo)準(zhǔn)，但檢測樣品中均未檢測到豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒核酸表達(dá)。熒光定量RT-PCR 特異擴(kuò)增曲線及內(nèi)參曲線結(jié)果如圖1、2、3 所示。

圖1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光定量RT-PCR 特異擴(kuò)增曲線及內(nèi)參曲線

4.2 細(xì)菌檢測結(jié)果

巧克力瓊脂培養(yǎng)基上生長出細(xì)小、灰色、針尖狀的小菌落，無溶血現(xiàn)象；在含有NAD 的TSA 固體培養(yǎng)基上生長出針尖大小、光滑、無色的圓形菌落。選取典型單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為菌體大小不等、雜亂分布、形態(tài)不一、無鞭毛無芽孢的短桿菌，出現(xiàn)少量球狀革蘭氏陰性菌。其生化特點(diǎn)為過氧化酶、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖呈陽性，甘露醇、甘露糖、木糖、尿素、蛋白胨水呈陰性。

實(shí)驗(yàn)小鼠均在接種后逐漸表現(xiàn)為精神沉郁、行動緩慢、蜷縮在鼠籠一側(cè)，被毛粗亂，呼吸急促，感染小鼠在24h 內(nèi)全部死亡并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，從小鼠臟器內(nèi)分離得到與接種菌相同特征的革蘭氏陰性菌。對照組小鼠狀態(tài)良好、無異常表現(xiàn)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見附表。該分離菌對氨芐西林、頭孢噻肟、氨芐西林等高敏。

附表 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

5 治療與防控

經(jīng)過臨床癥狀、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室診斷確定導(dǎo)致該豬群死亡的原因?yàn)楦必i嗜血桿菌感染所致。因此，建議及時(shí)將有臨床癥狀的病豬進(jìn)行隔離，加強(qiáng)環(huán)境消毒。發(fā)病豬采取注射青霉素或頭孢噻肟混懸劑，并在飼料中用阿莫西林與環(huán)丙沙星進(jìn)行治療，同時(shí)添加多種維生素和微量元素，提高豬群免疫力。為發(fā)病的其他豬群推薦使用阿莫西林和環(huán)丙沙星，阿莫西林及環(huán)丙沙星單獨(dú)飲水或拌料；或者將阿莫西林和環(huán)丙沙星拌料使用。經(jīng)過5d 的治療，死亡逐步減少，得到有效控制。

鑒于該豬場從年初就陸續(xù)出現(xiàn)生長發(fā)育緩慢、氣喘及陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，結(jié)合剖檢變化初步懷疑可能是豬瘟或圓環(huán)病毒為主同時(shí)繼發(fā)呼吸道細(xì)菌感染。但經(jīng)過查閱該場免疫程序及第三方抗體檢測結(jié)果顯示免疫合格率較高。經(jīng)過現(xiàn)場豬場檢查發(fā)現(xiàn)，該場由于處于建設(shè)初期，部分場所尚未完成，因此，不同日齡豬群在同一豬舍分區(qū)飼養(yǎng)，跨度較大，通風(fēng)不良導(dǎo)致舍內(nèi)氨氣濃度較高，因此，環(huán)境因素可能是導(dǎo)致副豬嗜血桿菌感染的主要原因。建議治療的同時(shí)修繕通風(fēng)設(shè)施，加強(qiáng)消毒，改善環(huán)境成為重中之重。

通過這個(gè)病例在養(yǎng)殖生豬中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）嚴(yán)格執(zhí)行全進(jìn)全出、自繁自養(yǎng)的原則，避免不同階段的豬只混養(yǎng)，保持合理的飼養(yǎng)密度[2]。（2）加強(qiáng)飼養(yǎng)環(huán)境管理，保持豬舍干燥衛(wèi)生，及時(shí)清理糞便，做好消毒[3]，并做好通風(fēng)，避免氨氣含量過高，以免刺激豬群呼吸道而誘發(fā)疾病。嚴(yán)格按照無害化處理程序處理病死豬，防止病原擴(kuò)散污染。（3）由于大多數(shù)疾病往往會混合感染，因此，要制定科學(xué)合理的免疫程序，并定期進(jìn)行疫病免疫排查工作，并在疫苗使用過程中添加增強(qiáng)免疫力的藥物。（4）減少仔豬斷奶、轉(zhuǎn)群時(shí)的應(yīng)激，在飲水中添加適量抗應(yīng)激藥物[4]。（5）在后續(xù)檢測過程中發(fā)現(xiàn)該豬群在用藥后病死情況得到有效控制，但在8 月份再次發(fā)生相同感染，因此，在加強(qiáng)管理的同時(shí)要進(jìn)行副豬嗜血桿菌免疫，尤其是鑒于該場的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下尤為重要。鑒于副豬嗜血桿菌血清型較多，多采用自家滅活菌苗進(jìn)行免疫預(yù)防。

圖2 豬瘟病毒熒光定量RT-PCR 特異擴(kuò)增曲線及內(nèi)參曲線

圖3 圓環(huán)病毒熒光定量RT-PCR 特異擴(kuò)增曲線及內(nèi)參曲線