朱孝揚(yáng)，沈 玲，司振偉，侯選文，陳維信，陸旺金，李雪萍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510642）

香蕉是世界上最重要的水果之一，是我國熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植的特色水果，也是我國華南地區(qū)出口和北運(yùn)的主要水果之一[1-2]。香蕉果肉中富含淀粉、糖、蛋白質(zhì)、果膠、VA、VB、VC、VE和鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[1]，營養(yǎng)價值高。香蕉，顧名思義，怡人的香氣是其顯著的特點(diǎn)，也正是因為香蕉具有良好的風(fēng)味品質(zhì)，一直深受人們的喜愛。

香蕉是典型的呼吸躍變型水果，在貯運(yùn)過程中，香蕉釋放出大量的乙烯，出現(xiàn)呼吸高峰，內(nèi)部組織發(fā)生一系列生理生化變化，具體表現(xiàn)為果皮由綠轉(zhuǎn)黃、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生、果肉軟化、含糖量增加、組織透性增加[3]。香蕉采收后，隨著香蕉的成熟衰老，耐貯藏性不斷下降，該特性嚴(yán)重制約了香蕉貯運(yùn)保鮮，生產(chǎn)上香蕉在運(yùn)銷過程中損失嚴(yán)重，可高達(dá)20%～30%或更多，嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[4]。因此，研究延緩香蕉成熟衰老和延長貨架壽命的方法有重要的意義。

香蕉果實特有的香氣是其吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場競爭力的重要因素之一。隨著國際市場對水果品質(zhì)的要求越來越高以及食品工業(yè)對天然風(fēng)味物質(zhì)需求的增加，果品香氣日益受到關(guān)注，已成為水果品質(zhì)的重要研究領(lǐng)域之一[5-6]。果實的香氣物質(zhì)不但和果實品質(zhì)有關(guān)，而且與果實的采后生理、貯藏加工以及微生物活動等方面有密切關(guān)系，其種類和含量是表征果實采后貯藏及貨架壽命的重要指標(biāo)之一[7-8]。影響果實香氣物質(zhì)含量和種類的因素很多，包括品種、種植方式和栽培區(qū)域、果實的采收成熟度和采后處理方式及貯藏方式等等[8-9]。目前已知香蕉果實的香氣成分有230種以上，主要為酯類、醇類和羰化物等[10]。

1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）作為一種安全無毒的乙烯受體抑制劑，可顯著延緩果蔬的成熟衰老[11-12]，并已成功地在蘋果、花卉等園藝產(chǎn)品商業(yè)貯藏保鮮中應(yīng)用。但是香蕉對1-MCP處理較敏感，如果1-MCP處理方法不當(dāng)，可影響香蕉成熟時果皮的正常轉(zhuǎn)黃和抑制香蕉香氣物質(zhì)的生成[11,13]，因此限制了1-MCP在香蕉貯藏保鮮中的應(yīng)用。經(jīng)過1-MCP處理的香蕉果實醇類物質(zhì)含量大量增加，而相應(yīng)的酯類物質(zhì)含量減少[13]，1-MCP對果實風(fēng)味的影響主要是抑制其芳香物質(zhì)的形成，減少果實的揮發(fā)性物質(zhì)總量[14]。1-MCP處理顯著抑制了粉蕉果實成熟過程中4種特征性酯類的生成，抑制了己醛與反-2-己烯醛的產(chǎn)生[7]。此外，1-MCP還會影響蘋果、油桃、獼猴桃果實香氣物質(zhì)的形成[15-16]。高濃度1-MCP處理有效延緩了獼猴桃品質(zhì)劣變，但是抑制了獼猴桃果味香氣物質(zhì)特別是酯類物質(zhì)的形成[17]。1-MCP處理延緩桃果實成熟衰老的同時，也改變了桃果實香氣物質(zhì)代謝模式[18]。在藍(lán)莓果實的研究中也發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理會顯著減少果實的香氣物質(zhì)形成，而1-MCP結(jié)合乙烯利處理能夠消除1-MCP對香氣物質(zhì)的影響[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，短時間乙烯利處理后再用1-MCP結(jié)合處理，可以有效消除香蕉果實轉(zhuǎn)色不均勻的后熟問題，也減輕了單獨(dú)1-MCP對香氣物質(zhì)的抑制作用[11]，但其對香氣合成影響的相關(guān)機(jī)理尚不明確。本研究進(jìn)一步探討1-MCP對香蕉果實香氣代謝的影響，為生產(chǎn)上延長香蕉果實貯藏壽命、提高貯藏品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試香蕉‘巴西’蕉（Musaspp. cv. ‘Brazil’）（7.5～8成熟），采自廣東省番禺市南沙區(qū)。

強(qiáng)力（二氧化氯清洗劑） 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所藥廠；抑菌鮮（異菌脲） 江蘇快達(dá)農(nóng)化股份有限公司；輝風(fēng)百克（咪鮮胺） 江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司；乙烯利 上海華誼集團(tuán)華原化工有限公司；各標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）及所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純，均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver 1.1、Agarose Gel DNA Purification Kit日本Takara公司；Invitrogen M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Premix ExTaq II試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；G3900型氣相色譜儀 日本島津有限公司；ICS3000多功能離子色譜儀 美國Dionex公司；IQ5熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國伯樂有限公司；BILON96-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海比朗公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將采收的香蕉當(dāng)天運(yùn)回實驗室，蕉指落梳，并將每梳香蕉切分單個果指，用清水洗凈，放入2 g/L的強(qiáng)力中浸泡10 min，然后用濃度均為500 μL/L的抑菌鮮和輝風(fēng)百克混合溶液浸泡1 min進(jìn)行殺菌處理，取出晾干備用。將預(yù)處理后的樣品分為3組，每組120 根香蕉，分別進(jìn)行如下處理：1）直接將果實放入密封罐中，密封16 h（對照）；2）用50 μL/L乙烯利溶液浸泡1 min，然后自然晾干，3 h后用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（乙烯利+1-MCP處理組）；3）直接用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（1-MCP處理組）。所有處理均在（25±1）℃條件下進(jìn)行，所有樣品處理完后裝入厚0.03 mm的防霧保鮮袋內(nèi)，不封口，裝箱置于（25±1）℃條件下貯藏，處理組和對照組在貯藏第14天時取出，用800 μL/L乙烯利催熟，催熟溫度為（25±1）℃。各處理均設(shè)3個重復(fù)。定期監(jiān)測果實成熟進(jìn)程，取樣及測定揮發(fā)性物質(zhì)的組分與含量。

1.3.2 果實香氣物質(zhì)的測定

參考朱虹等[20]的方法，選用DVB/CAR/PDMS萃取頭提取香蕉果實揮發(fā)性物質(zhì)。取香蕉果實中段的果肉，用榨汁機(jī)壓榨成細(xì)小顆粒，取5 g果肉于20 mL采樣瓶中，密封瓶蓋，將萃取頭插入瓶中頂空部分，與樣品表面保持1.5 cm距離，萃取溫度約為常溫，萃取25 min。每處理3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。通過GC-MS技術(shù)將采集到的質(zhì)譜圖在NIST譜庫搜索，與有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行核對，同時對峰面積進(jìn)行歸一化定量，得到各組分的相對含量，再結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實際成分和保留指數(shù)等參數(shù)確定香蕉果實中共有8種主要揮發(fā)性物質(zhì)，分別為乙酸異丁酯、丁酸異戊酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯、乙酸乙酯、己醛、反-2-己烯醛以及乙醇。使用G3900型氣相色譜儀對這8種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析，建立GC外標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間對GC譜圖的組分峰定性，以峰面積表征各物質(zhì)含量。

GC條件：25301-U SupelcoWax10極性毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）；載氣He（99.99%），流速1.0 mL/min，氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃，不分流，固相微萃取進(jìn)樣熱解析脫附時間5 min。程序升溫：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min升溫至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/ min升溫至180 ℃，保持1 min。

1.3.3 香氣代謝相關(guān)酶活力的測定

1.3.3.1 脂氧合酶活力的測定

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力測定參考朱虹[21]的方法，取1 g果肉于研缽內(nèi)，加入5 mL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含體積分?jǐn)?shù)1% Triton X100 和1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）），冰浴勻漿。然后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液（酶提取液）待測。3 mL的反應(yīng)體系中含有：0.1 mol/L亞油酸鈉溶液0.2 mL、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 6.0）2.7 mL和酶提取液0.1 mL。反應(yīng)體系經(jīng)30 ℃水浴5 min后加入2.4 mL無水乙醇終止反應(yīng)，于234 nm波長處測定吸光度。每組實驗3次重復(fù)。

1.3.3.2 醇?；D(zhuǎn)移酶活力的測定

醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）活力測定參考Pérez等[22]的方法。酶提取液的制備：稱取0.4 g果肉樣品，加入4 mL蛋白提取液（0.1 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100、1 g/100 mL聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethephon diamine tetra-acetic acid，EDTA），冰浴提取20 min，12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液。

AAT活力測定：反應(yīng)液組成為：2.5 mL 5 mmol/L MgCl2溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液）、150 μL 5 mmol/L乙酰輔酶A溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液）、50 μL 200 mmol/L丁醇溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液）和150 μL酶提取液。將以上組分混合后放置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB），室溫下放置10 min，412 nm波長處比色，以不含酶提取液的反應(yīng)液為空白。以每克鮮組織1 min內(nèi)吸光度升高0.001為一個活力單位（U），單位為U/g。

1.3.3.3 乙醇脫氫酶活力的測定

參考Lara等[23]的方法進(jìn)行酶提取液制備。取1 g果肉樣品液氮研磨，加入5 mL蛋白提取液（85 mmol/L pH 6.0嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）緩沖液、1 g/100 mL PVPP、5 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），25 000×g、4 ℃離心15 min，上清液即為酶提取液。乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活力采用試劑盒進(jìn)行測定。以每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol產(chǎn)物的酶量定義為一個酶活力單位（U），ADH活力單位為U/mg，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析

RNA的分離采用熱硼酸法[24]。按照RNA LA PCRTM Kit（AMV）Ver 1.1試劑盒說明書提取香蕉果肉組織樣品的總RNA并合成cDNA第1鏈，貯存于－20 ℃。

根據(jù)從NCBI上獲得的各個基因的序列，設(shè)計熒光引物（表1），選取ACT1為內(nèi)參基因[25]。按SYBR Premix ExTaqII試劑盒說明配制PCR體系，運(yùn)行程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。測定其Ct值，用2－ΔΔCt計算各樣品各個基因的相對表達(dá)量。

表1 研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與統(tǒng)計分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SigmaPlot 10.0軟件作圖。使用SPSS 13軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析，具體采用鄧肯氏新復(fù)極差（Duncan’s multiple ranger test，DMRT）檢驗法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著）。采用R軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對香蕉采后果肉中揮發(fā)性物質(zhì)的影響

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理顯著抑制了香蕉果實的香氣物質(zhì)合成，乙烯利+1-MCP處理有效緩解了單獨(dú)1-MCP處理對香氣的影響[11]。反-2-己烯醛和己醛是香蕉綠硬期特征香氣物質(zhì)。從圖1可以看出，與對照組相比，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理延緩了綠硬期特征香氣物質(zhì)（反-2-己烯醛和己醛）的高峰出現(xiàn)，意味著乙烯利+1-MCP和1-MCP兩個處理都能明顯延緩香蕉的后熟，同時乙烯利+1-MCP處理組反-2-己烯醛和己醛含量在到達(dá)高峰之后快速下降，表明該組果實在催熟之后醛類很快地被轉(zhuǎn)化為其他香氣物質(zhì)。對照組和乙烯利+1-MCP處理中己醛和反-2-己烯醛含量在整個貯藏期間在的變化趨勢相同，均先上升后下降。對照組中己醛和反-2-己烯醛的含量高峰都出現(xiàn)在第10天，然后急速下降；乙烯利+1-MCP和1-MCP處理組在催熟前（前14 d）兩個物質(zhì)含量變化緩慢，催熟后上升較快；乙烯利+1-MCP處理組中兩種物質(zhì)的含量高峰都出現(xiàn)在第18天，然后急劇下降；而1-MCP處理中兩種物質(zhì)含量一直處于上升階段。3個組中兩種物質(zhì)含量高峰出現(xiàn)時間不同，表明了3個組的香蕉成熟進(jìn)程均不一致。

圖1 不同處理對香蕉綠硬時期特征揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響Fig. 1 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in green ripe bananas

從圖2可以看出，乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組在香蕉催熟后才有少量的酯類物質(zhì)產(chǎn)生，乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組酯類物質(zhì)含量上升更快，貯藏末期的含量更高。表明乙烯利+1-MCP處理組中首先乙烯結(jié)合香蕉中的乙烯受體，啟動乙烯信號通路。乙烯與1-MCP形成競爭能夠顯著減少1-MCP對香蕉后熟及其香氣帶來的不良影響。

圖2 不同處理對香蕉黃熟期特征揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響Fig. 2 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in yellow ripe bananas

前期的研究發(fā)現(xiàn)乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯和丁酸異戊酯為香蕉果實的黃熟期特征揮發(fā)性化合物[8,10]。如圖2所示，黃熟期4種特征物質(zhì)在各組表現(xiàn)如下：對照組中這4種物質(zhì)在前10 d含量為0，乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組都是在催熟后才有少量的酯類物質(zhì)產(chǎn)生，果實開始啟動成熟后，除乙烯利+1-MCP處理組的乙酸異戊酯含量在第18天有一個高峰外，這兩組4種酯類物質(zhì)含量一直保持上升的趨勢，且乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組在催熟后能較快地產(chǎn)生這4種特征性酯類物質(zhì)，在貯藏末期，除了乙酸異戊酯，乙烯利+1-MCP處理組其他3種特征性酯類物質(zhì)含量高于1-MCP處理組。

乙醇和乙酸乙酯兩個物質(zhì)是過熟期特征揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)生這兩種物質(zhì)代表香蕉進(jìn)入了無氧呼吸階段和衰老階段。從圖3可以看出，兩種物質(zhì)大量產(chǎn)生的時期都在貯藏末期，在此期間，3個組的香蕉都發(fā)生了很強(qiáng)的無氧呼吸；乙烯利+1-MCP處理和1-MCP處理延緩了香蕉進(jìn)入衰老階段。對照組在第10天便有少量的乙醇產(chǎn)生，乙酸乙酯的產(chǎn)生出現(xiàn)在第12天，之后兩種物質(zhì)含量一直上升；乙烯利+1-MCP處理組的乙醇和乙酸乙酯都產(chǎn)生于第14天，之后含量也持續(xù)上升；1-MCP處理組的乙醇和乙酸乙酯出現(xiàn)分別在第18天和第16天。在貯藏第20天，3組之間的乙醇含量無顯著差異，對照組和乙烯利+1-MCP處理組的乙酸乙酯含量有差異，但是差異相對較小，均顯著高于1-MCP處理組?？傮w來說，單獨(dú)1-MCP處理和乙烯利結(jié)合1-MCP處理都明顯延緩和抑制香蕉果實不同成熟期特征香氣物質(zhì)形成，但乙烯利+1-MCP處理組與對照組相比各物質(zhì)含量更接近，其香氣物質(zhì)高峰值都明顯高于單獨(dú)1-MCP處理組。

圖3 不同處理對香蕉過熟期特征揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in over-ripe bananas

2.2 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對香蕉香氣代謝相關(guān)關(guān)鍵酶活力和基因表達(dá)的影響

2.2.1 LOX活力和基因表達(dá)的變化

LOX是香氣代謝中脂肪酸代謝途徑的重要酶。從圖4A可知，各組香蕉在貯藏過程中的LOX活力均先下降后上升，且在貯藏末期LOX活力明顯低于初期。對照組LOX活力低峰出現(xiàn)在第10天，此時LOX活力為0.37 U/g，乙烯利+1-MCP組和1-MCP處理組LOX活力低峰均出現(xiàn)在第16天，此時LOX活力分別為0.32、0.38 U/g，兩組之間無顯著差異。LOX活力變化趨勢和己醛、反-2-己烯醛含量的變化趨勢完全相反。

如圖4B所示，LOX基因在香蕉果肉中的表達(dá)量較低，對照組中，LOX基因表達(dá)量在貯藏的第10天急劇下降到很低水平，且此后表達(dá)量一直保持在低水平。乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組在貯藏的0～5 dLOX基因表達(dá)量急劇下降，第5天時顯著低于對照組。乙烯利+1-MCP處理組LOX基因表達(dá)量在0～10 d急劇上升，10 d后逐漸下降，后期與對照組差異不顯著。1-MCP處理組LOX基因表達(dá)量5～12 d上升，12～14 d下降，14～16 d上升，并在第16天達(dá)到高峰，且高于對照組的最高表達(dá)量，然后急劇下降到低水平，且在第20天時與其他兩組無顯著差異。

總體來說，單獨(dú)1-MCP處理和乙烯利結(jié)合1-MCP處理都在貯藏前期提高了LOX活力，貯藏后期抑制了其活力，同時延緩LOX基因表達(dá)高峰的出現(xiàn)，但不降低峰值。

圖4 不同處理對香蕉LOX活力（A）和LOX基因表達(dá)量（B）的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of LOX

2.2.2 乙醇脫氫酶活力和基因表達(dá)的變化

ADH是香氣代謝中氨基酸代謝途徑的中端酶，該酶的活力與醇類的含量緊密相關(guān)，能夠催化醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇，乙醇與乙酰輔酶A在AAT催化下形成乙酸乙酯。因此ADH也能夠為香蕉中的酯類物質(zhì)的形成提供前體物質(zhì)，也是香氣代謝的關(guān)鍵酶。如圖5A所示，對照組ADH活力在整個貯藏期間不斷上升，乙烯利+1-MCP處理組的ADH的活力在催熟前受到抑制，但催熟后ADH活力出現(xiàn)上升趨勢。1-MCP處理組活力低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組。貯藏結(jié)束時，乙烯利+1-MCP處理組和對照組ADH活力無顯著差異，且均顯著高于1-MCP處理組。

由圖5B、C可知，各組香蕉在貯藏過程中ADH基因表達(dá)量整體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉ADH1表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，并降低峰值大小，且乙烯利+1-MCP處理組ADH1表達(dá)量峰值高于1-MCP處理組。1-MCP處理對ADH2基因表達(dá)的抑制效果相對ADH1更明顯，乙烯利結(jié)合1-MCP處理能夠有效減弱1-MCP對香氣代謝中ADH基因表達(dá)的抑制作用。對于ADH2表達(dá)量，對照組、乙烯利+1-MCP處理組、1-MCP處理組高峰出現(xiàn)的時間分別為第10、10、12天，且乙烯利+1-MCP處理組和對照組組高峰值無顯著差異，但是1-MCP處理組高峰值明顯低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組高峰值，說明1-MCP抑制了ADH2基因的表達(dá)。

圖5 不同處理對香蕉貯藏期間ADH活力（A）和ADH1（B）、ADH2（C）基因表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the activity of ADH (A) and gene expression of ADH1 (B) and ADH2 (C)

2.2.3 AAT活力和基因表達(dá)的變化

AAT是香氣代謝中氨基酸代謝途徑的重要酶，也是該途徑中的末端酶，AAT的活力直接影響到酯類物質(zhì)的含量。從圖6A可知，AAT活力的變化與ADH活力變化趨勢一致，對照組AAT活力在整個貯藏期間不斷上升，乙烯利+1-MCP處理中AAT活力在催熟前受到一定抑制，其活力低于對照組，但催熟后AAT活力迅速上升。1-MCP處理組AAT活力在整個貯藏期均顯著低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組。貯藏末期，乙烯利+1-MCP處理組和對照組AAT活力接近，與1-MCP處理組差異顯著。

如圖6B所示，對照組AAT表達(dá)量同ADH表達(dá)量變化趨勢一致，都是呈現(xiàn)先上升然后下降的趨勢。乙烯利+1-MCP處理組中AAT在0～5 d幾乎不表達(dá)，在前10 d的表達(dá)都較低，而后逐步升高再逐步降低。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中AAT基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，卻并未降低峰值的大小，乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組催熟后AAT基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)得更早。

圖6 不同處理對香蕉AAT活力（A）和AAT基因表達(dá)量（B）的影響Fig. 6 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of AAT

2.2.4BCAT和PDC基因表達(dá)量

支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCAT）在香蕉香氣氨基酸代謝途徑中是起始酶，使支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基后轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的酮酸，為香氣代謝提供前體物質(zhì)。從圖7A可知，各組果實BCAT表達(dá)量在前10 d較低，對照組在第12天急劇上升至高峰，而后逐步降低至平穩(wěn)狀態(tài)；乙烯利+1-MCP處理組BCAT表達(dá)量在12 d后開始逐漸上升，至第18天到達(dá)高峰；1-MCP處理組在14 d后才開始逐漸上升，至第20天達(dá)到表達(dá)高峰。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中BCAT基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，卻并未降低峰值的大小。相對單獨(dú)1-MCP處理，乙烯利+1-MCP處理誘導(dǎo)了香蕉果實在成熟期BACT表達(dá)。

丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）是香蕉香氣氨基酸代謝途徑中的中間酶。由圖7B可知，PDC表達(dá)量沒有典型的變化趨勢，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉PDC基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，并降低峰值的大小，其中1-MCP處理抑制效果更加明顯。1-MCP會抑制香氣代謝中PDC基因的表達(dá)，從而抑制了香氣物質(zhì)的生成，乙烯利結(jié)合1-MCP處理會一定程度減輕這種抑制作用。

圖7 不同處理對香蕉香氣代謝中BCAT（A）和PDC（B）基因表達(dá)量的影響Fig. 7 Effect of ethephon combined with 1-MCP on the expression of BCAT (A) and PDC (B) genes

2.2.5 香氣成分含量與香氣合成關(guān)鍵酶活力和基因表達(dá)量相關(guān)性分析

如表2所示，己醛含量與ADH1表達(dá)量呈極顯著相關(guān)；反-2-己烯醛含量與LOX活力顯著相關(guān)，與ADH1表達(dá)量呈顯著相關(guān)，乙醇含量與ADH活力呈顯著相關(guān)，與AAT活力呈極顯著相關(guān)；酯類含量與ADH活力、AAT活力都均呈極顯著相關(guān)；總揮發(fā)性物質(zhì)含量與ADH活力、AAT活力也呈顯著或極顯著相關(guān)。各基因中，僅ADH1表達(dá)量表現(xiàn)出與揮發(fā)性物質(zhì)中的醛類物質(zhì)含量有極顯著相關(guān)性，其他基因的表達(dá)量與揮發(fā)性物質(zhì)含量均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，說明香氣代謝中的相關(guān)酶與香氣代謝的關(guān)系比基因表達(dá)與香氣代謝的關(guān)系更為密切。

表2 貯藏期間香蕉香氣物質(zhì)含量與相關(guān)酶活力、基因表達(dá)量之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of volatile substances with enzyme activities and gene expression in banana fruits during ripening process

2.3 主成分分析

香蕉的香氣物質(zhì)主要在果實成熟后期形成。為了研究不同處理對香氣物質(zhì)的影響，對貯藏12 d后所有測定指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析。如圖8所示，PC1和PC2可以解釋所有組分的68.8%，其中PC1占46.89%，PC2占21.91%。相對于對照，不同處理都對香蕉果實后期的香氣成分和酶活力以及基因表達(dá)量產(chǎn)生了顯著影響（圖8A）。盡管不同處理組沒有完全分開，但是不同處理組之間差異顯著（R2=0.22、P=0.005）。從圖8B中可以出，乙酸乙酯、丁酸異戊酯、丁酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙醇含量和ADH、AAT活力為主成分PC1的主要的貢獻(xiàn)者，這也和香蕉成熟過程中的特征香氣物質(zhì)相符合。而己醛含量和AAT、ADH2、PDC、BACT基因表達(dá)量，以及反-2-己烯醛含量為主成分PC2的主要貢獻(xiàn)者。這解釋了這些香氣物質(zhì)、酶活力以及基因表達(dá)對香蕉果實后期香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)較大。而表3展示的是不同處理樣品對于主成分的貢獻(xiàn)值，與對照相比，1-MCP處理整體上對主成分PC1和PC2的影響更大，而乙烯利+1-MCP處理相對單獨(dú)1-MCP處理來說，對主成分PC1和PC2的整體影響較小。說明乙烯利+1-MCP處理能顯著減輕單獨(dú)1-MCP處理對果實香氣物質(zhì)的影響。

圖8 不同處理條件下香蕉果實貯藏12 d后各指標(biāo)之間主成分分析（A）及各指標(biāo)在主成分PC1和PC2中的比重（B）Fig. 8 Principal components analysis (PCA) of aroma components,aroma synthesis-related enzyme activities and gene expression in banana fruits under different treatment conditions after 12 days of storage (A)and contribution of each component to PC1 and PC2 (B)

表3 不同樣品對主成分貢獻(xiàn)值Table 3 Contribution of first five PCs to total variance for different samples

3 討 論

3.1 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對香蕉中香氣物質(zhì)形成的影響

1-MCP對果實風(fēng)味的影響主要是抑制其芳香物質(zhì)的形成，果實的揮發(fā)性醇和酯總量減少[14]。香蕉果實主要在呼吸躍變高峰出現(xiàn)前后產(chǎn)生揮發(fā)性芳香物質(zhì)，香蕉果實在成熟后期產(chǎn)生大量的酯類，這是果香型香氣的主要成分，酯類物質(zhì)的產(chǎn)生需要乙烯的作用，而1-MCP處理明顯降低了組織對乙烯的敏感性。1-MCP處理導(dǎo)致果實呼吸速率下降和代謝活性的下降，可能導(dǎo)致香氣合成底物供給不足，從而改變揮發(fā)性物質(zhì)形成的途徑，進(jìn)而改變了芳香物質(zhì)的量。不僅在香蕉上有這樣的結(jié)果，在蘋果、油桃、梨、獼猴桃、桃等水果中都有類似的現(xiàn)象[15-18]。在采收成熟度較高的粉蕉果實上，1-MCP處理濃度過高或時間過長，也會導(dǎo)致粉蕉果實果皮轉(zhuǎn)色和果肉軟化不一致[26]，這些都限制了1-MCP在香蕉貯藏保鮮中的應(yīng)用。

乙烯利+1-MCP處理不但能顯著延緩香蕉衰老和延長保鮮期，解決1-MCP引起的果皮轉(zhuǎn)黃不均勻的后熟障礙問題，而且能極大改善香氣的種類、總量、酯類含量。乙烯利+1-MCP處理組香蕉果實對乙烯有正常的響應(yīng)，揮發(fā)性物質(zhì)含量相對于單獨(dú)1-MCP處理組上升更快[11]。在本實驗中進(jìn)一步驗證了1-MCP結(jié)合乙烯利處理可以顯著減輕單獨(dú)1-MCP處理對香氣物質(zhì)形成的影響。

香氣的產(chǎn)生與乙烯的作用密切相關(guān)。乙烯實際上是通過調(diào)節(jié)香蕉后熟進(jìn)程而間接影響其揮發(fā)性物質(zhì)的變化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯能增加蘋果特征香氣物質(zhì)積累，而乙烯作用抑制劑1-MCP則起著相反的作用，顯著抑制了蘋果“果香型”香氣物質(zhì)的含量，乙烯和1-MCP通過調(diào)控香氣合成相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控香氣的合成[16]。蘋果低溫貯藏條件下乙烯釋放量和特征香氣物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)性，因此乙烯釋放量可以作為評價蘋果香氣物質(zhì)的潛在指標(biāo)，達(dá)到無損簡易檢測的目的[27]。Shalit等比較了呼吸躍變型和非躍變型兩種甜瓜品種的香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)躍變型果實能產(chǎn)生大量乙烯，有很濃的香氣；非躍變型果實釋放的乙烯較少，而香氣也較淡[28]。新近的研究報道，甜瓜中乙烯合成關(guān)鍵基因ACO1的RNA干擾顯著影響了果實成熟，主要通過影響相關(guān)基因的低甲基化，抑制了成熟相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響氨基酸分解代謝的芳香族化合物的積累[29]。番茄果實中，果實成熟相關(guān)的自催化系統(tǒng)II乙烯對番茄成熟期特征香氣物質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用，決定了番茄紅熟期的風(fēng)味[30]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NOR/NAC的甲基化修飾，調(diào)控酯類代謝關(guān)鍵基因AAT的甲基化修飾，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控不同果實包括番茄、桃和蘋果的酯類物質(zhì)形成[31]。對于非呼吸躍變型果實的香氣物質(zhì)形成，乙烯也起著重要的作用。Sdiri等分析了乙烯退綠對不同品種柑橘香氣的影響，發(fā)現(xiàn)一些柑橘品種的香氣也受到乙烯處理的影響[32]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，香蕉果實成熟過程中乙烯的釋放量與乙醇、酯類物質(zhì)和總揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量呈極顯著正相關(guān)[11]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理降低了香蕉揮發(fā)性物質(zhì)的總量和酯類含量，在貯藏末期也未能改變這種現(xiàn)象，揮發(fā)性物質(zhì)的總量和酯類含量仍然低于對照組。而用1-MCP結(jié)合乙烯的香蕉與1-MCP處理組相比，提高了揮發(fā)性物質(zhì)的總量和酯類含量，有效地改善了1-MCP對香蕉香氣的抑制作用，這種作用在催熟后更為明顯，也表明了乙烯對香氣調(diào)控的重要作用。對于梨果實，長期低溫貯藏后，相對于單獨(dú)1-MCP處理來說，1-MCP結(jié)合乙烯處理也能顯著改善貨架期梨果實的香氣，有效保持果實的風(fēng)味[33]。

3.2 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對香蕉香氣脂肪酸代謝途徑相關(guān)酶活力和基因表達(dá)的影響

果實香氣成分中的直鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)主要來源于脂肪酸氧化。直鏈脂肪族醛類及其他香氣物質(zhì)主要通過脂肪酸代謝途徑中的β-氧化和LOX氧化實現(xiàn)。LOX氧化產(chǎn)生的C6醛和C6醇等果實青香氣味[34-35]。脂肪酸作為酯類合成的前體之一，主要通過β-氧化和LOX氧化這兩種途徑生成。LOX催化植物中亞油酸、亞麻酸這兩種主要的多聚不飽和脂肪酸底物發(fā)生過氧化氫化反應(yīng)，產(chǎn)生9-(S)-或13-(S)-氫過氧十八碳二烯酸或9-(S)-或13-(S)-氫過氧十八碳三烯酸，經(jīng)過進(jìn)一步代謝，如經(jīng)氫過氧化物裂解酶催化轉(zhuǎn)化為醛類、醇類和揮發(fā)性酯類[36]，所以LOX在果實直鏈型揮發(fā)性物質(zhì)的生成過程中起到了重要作用。

在本研究中，香蕉貯藏過程中LOX活力變化趨勢和己醛、反-2-己烯醛含量的趨勢完全相反，對照組、乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組的LOX基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時間依次延后，說明乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中LOX基因的表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)己醛含量與LOX活力、LOX基因表達(dá)量無顯著相關(guān)性，推測己醛的產(chǎn)生與LOX活力和LOX基因表達(dá)關(guān)系不大。有研究報道稱，果實芳香成分中直鏈脂肪族醇、醛、酮物質(zhì)主要來源于脂肪酸代謝路徑。部分果實的芳香揮發(fā)物合成途徑中，脂肪酸是主要的前體物質(zhì)，脂肪酸經(jīng)過氧化作用成類脂，然后經(jīng)LOX催化形成醛、酮、酸、醇、內(nèi)酯和酯等芳香物質(zhì)[37]。完整果實的芳香揮發(fā)物通過β-氧化途徑合成[37]，而當(dāng)果實組織腐爛后則通過LOX途徑合成，因此推測香蕉綠硬時期的特征香氣物質(zhì)中的直鏈脂肪族醛類并不是來源于LOX途徑，而主要是通過β-氧化路徑合成。

3.3 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對香蕉香氣氨基酸代謝途徑相關(guān)酶活力和基因表達(dá)的影響

果實香氣成分中支鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)主要來源于氨基酸代謝。氨基酸通過轉(zhuǎn)氨作用形成支鏈酮酸，一條途徑是在脫羧酶作用下生成醛，然后在ADH的作用下生成醇；另一條途徑是與輔酶A（CoA）生成?；鵆oA，然后在AAT作用下生成酯。支鏈氨基酸首先通過轉(zhuǎn)氨基作用生成支鏈α-酮酸，這個過程需要在BCAT催化作用下進(jìn)行，再在PDC的作用下脫羧生成相應(yīng)的醛類。

3.3.1 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對ADH活力及基因表達(dá)的影響

脂肪酸和氨基酸代謝產(chǎn)生的醛在ADH的作用下形成醇類物質(zhì)。蘋果中的ADH以NAD和NADH為輔因子，其ADH在體外pH值為5.5～6.0時將醛還原成醇，pH值為7.0～10.0時將醇氧化為醛[38]。因此，ADH可能與香蕉香氣中的醇類和醛類含量有著密切的聯(lián)系。Defilippi等發(fā)現(xiàn)1-MCP并不會影響ADH的活力，但會抑制AAT活力[39]。

本實驗結(jié)果表明，乙烯利+1-MCP處理會抑制ADH活力，但該抑制作用并不是不可逆的，在果實催熟后，該酶活力很快出現(xiàn)上升的趨勢，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中ADH1基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，且降低了峰值的大小。乙烯利+1-MCP處理組ADH1基因表達(dá)量峰值較1-MCP處理組更大；1-MCP處理明顯抑制了ADH2基因的表達(dá)，使其整個貯藏過程表達(dá)量都很低，而乙烯利+1-MCP處理組ADH2表達(dá)量與對照組整體上差異不大；表明乙烯利結(jié)合1-MCP處理能夠有效降低或者消除1-MCP對香氣代謝中ADHs基因表達(dá)的抑制，以此達(dá)到增加香氣物質(zhì)和改善果實品質(zhì)的目的。ADHs基因表達(dá)量的高峰出現(xiàn)時間早于ADH活力高峰出現(xiàn)時間，乙醇含量和ADH活力變化趨勢一致，但ADH活力開始快速增加時間點(diǎn)早于乙醇，因此，當(dāng)ADHs基因表達(dá)量達(dá)到高峰之后，ADH活力才快速上升，然后才產(chǎn)生大量的乙醇。推測香氣的形成與ADH活力和ADH基因表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。

3.3.2 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對AAT活力及基因表達(dá)的影響

酯類物質(zhì)的合成由醇和?；?CoA在AAT的作用下合成，這一過程為需氧過程[38]。AAT活力及其對底物的選擇性影響果實香氣成分中酯類的含量和種類。Pérez等對4個品種草莓果實成熟期間AAT活力的研究表明，各品種AAT活力均隨果實成熟而增加，但不同品種最大活力差異很大，活力越低風(fēng)味也越差[22]。缺乏香氣的甜瓜品種‘Rochet’果實無AAT活力[28]。香蕉果實AAT最適底物為乙酰-CoA、丙酰-CoA和丁醇，而對丁酰-CoA活力很低[40]。醇的供應(yīng)被認(rèn)為是AAT催化酯類合成的限制因子，體外供應(yīng)丁醇，蘋果果實的乙酸丁酯和丁酸酯類合成增加，體外供應(yīng)乙醇和己醇則促進(jìn)乙酯和己酯的合成[39]。因此，AAT可能與香蕉香氣中的酯類物質(zhì)的合成密切相關(guān)。

本實驗結(jié)果表明，AAT活力在整個貯藏期間不斷上升，貯藏結(jié)束時，乙烯利+1-MCP處理組和對照組AAT活力接近，且顯著高于1-MCP處理組。這表明乙烯利+1-MCP處理對AAT活力的抑制作用不是不可逆的。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉AAT基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，卻并未降低峰值的大小。結(jié)合揮發(fā)性物質(zhì)的量分析，酯類含量和AAT活力變化趨勢一致，當(dāng)AAT基因表達(dá)量達(dá)到高峰之后，才出現(xiàn)較高的AAT活力，繼而產(chǎn)生大量的酯類物質(zhì)產(chǎn)生。因此酯類的含量與AAT活力具有極顯著的相關(guān)性，AAT在酯類的生成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

3.3.3 乙烯利結(jié)合1-MCP處理對氨基酸途徑中BCAT和PDC基因表達(dá)的影響

BCAT通過轉(zhuǎn)氨基作用將纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸轉(zhuǎn)化為酮酸，酮酸再在PDC的作用下脫羧生成相應(yīng)的醛類[41]，這兩個酶是氨基酸代謝途徑的起始酶，因此BCAT和PDC基因表達(dá)也與香氣代謝密切相關(guān)。但是關(guān)于1-MCP對BCAT和PDC基因表達(dá)的影響較少報道。本實驗中，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中支鏈BCAT基因表達(dá)高峰的出現(xiàn)，卻并未降低峰值的大小。對照組PDC基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升后下降再上升再下降的趨勢。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉PDC基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，降低了峰值的大小，但是1-MCP處理組PDC表達(dá)量高峰僅在貯藏后期才出現(xiàn)，而乙烯利+1-MCP處理和對照組PDC基因表達(dá)量峰值都出現(xiàn)在貯藏前期。說明1-MCP會影響了PDC基因表達(dá)，從而影響了香氣物質(zhì)在貯藏期的生成，而乙烯利結(jié)合1-MCP處理能減輕了這種影響，在貯藏前期便出現(xiàn)表達(dá)高峰。

本實驗揭示了乙烯利+1-MCP處理對香蕉成熟過程中揮發(fā)性物質(zhì)、香氣合成相關(guān)關(guān)鍵酶活力和相關(guān)基因的表達(dá)特性的影響以及它們之間的關(guān)系，為香蕉采后的1-MCP處理保鮮技術(shù)提供理論指導(dǎo)，也為1-MCP處理在香蕉產(chǎn)業(yè)上的商業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論參考。