孔 蕊，柴秀偉，梁 偉，朱亞同，李寶軍，李永才，畢 陽(yáng),*，Prusky DOV

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.農(nóng)業(yè)研究組織新鮮農(nóng)產(chǎn)品采后科學(xué)部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

胡蘿卜（Daucus carotaL. var. sativa Hoffm）是重要的園藝作物，世界各國(guó)普遍栽培。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）統(tǒng)計(jì)，2018年全世界年產(chǎn)蘿卜42 814 538 t，我國(guó)產(chǎn)量達(dá)20 574 774 t，占世界產(chǎn)量的近一半[1-2]。由于胡蘿卜根直皮薄，且多為機(jī)械采收，采收和采后處理期間極易對(duì)直根表皮造成機(jī)械損傷，致使其易受到以灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）為主的致腐病原菌的侵染[3]。

熱水處理是一種安全有效的采后處理方法，在控制果蔬采后病害、延緩成熟衰老并保持產(chǎn)品品質(zhì)方面具有重要作用[4]。有研究表明，熱水處理可以通過(guò)激活苯丙烷代謝，提高H2O2含量和過(guò)氧化物酶活性，促進(jìn)馬鈴薯塊莖傷口部位軟木脂和木質(zhì)素的積累[5]。熱水處理可提高山藥活性氧和酚類物質(zhì)代謝水平，促進(jìn)切口部位木栓質(zhì)快速形成，有效降低了腐爛率和質(zhì)量損失率[6]。此外，熱水處理還可有效控制地下根莖類蔬菜的采后病害，例如，57.5 ℃熱水浸泡20 min可有效減輕由Fusarium sulphureum引起的馬鈴薯干腐病[7]，55 ℃熱水噴淋45 s可以有效抑制由Rhizopus stolonifer引起的甘薯軟腐病[8]。熱處理控制果蔬采后病害的機(jī)制除直接抑制或殺死病原菌外[9]，還可以激活苯丙烷代謝[10]，促進(jìn)熱休克蛋白和病程相關(guān)蛋白積累，以及抗菌物質(zhì)的合成[11]。盡管已有熱水處理促進(jìn)馬鈴薯和山藥愈傷的報(bào)道，但熱水處理是否影響胡蘿卜采后愈傷鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用熱水處理人工損傷的胡蘿卜，測(cè)定損傷胡蘿卜愈傷期間的質(zhì)量損失率和病情指數(shù)，觀察聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP）和木質(zhì)素在傷口處的積累，測(cè)定胡蘿卜傷口處的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力以及產(chǎn)物含量。以期為熱水處理在胡蘿卜采后愈傷中的應(yīng)用提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘新黑田五寸’胡蘿卜于2020年8月26日采自甘肅省金昌市永昌縣金玉宏蔬菜園，選取外觀良好、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的胡蘿卜，立即裝入包裝箱，于當(dāng)天運(yùn)抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，于常溫（（20±3）℃、相對(duì)濕度70%～80%）環(huán)境下貯藏備用。

供試灰葡萄孢霉（Botrytis cinereaPers.）由中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)待用。

無(wú)水乙醇、氯化鎂、乙酸、丙酮、硼酸、羥胺鹽酸、溴化乙酰 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、福林-酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲苯胺藍(lán)上海中秦化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇、鹽酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、苯甲磺酰氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（polyvingypyrrolidone，PVPP 北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸 上海凜恩科技發(fā)展有限公司；Triton X-100 北京酷來(lái)搏科技有限公司；4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）提取液 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋、THZ-100型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科技術(shù)有限公司；SPX-30085H-II型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HF036型刮皮刀 陽(yáng)江市陽(yáng)東區(qū)焦點(diǎn)刀具有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；CX21FS1C型生物顯微鏡奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司；UV-2450型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；Centri Vap真空離心濃縮儀 美國(guó)Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超快速液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；BS-QT-013型微孔濾膜（0.22 μm） 美國(guó)Biosharp公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡、CX21FS1C型熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 胡蘿卜損傷及熱水處理

胡蘿卜人工損傷參照Z(yǔ)hang Xuemei等[12]的方法并并適當(dāng)修改。胡蘿卜清洗后用體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉消毒2 min，蒸餾水沖洗，晾干，用消毒的刮皮刀在每個(gè)直根距離頂部與底部40 mm的部位削出2個(gè)50 mm×20 mm×1 mm的傷口，室溫下晾干。

熱水浸泡處理參照Yang Ruirui等[5]的方法。將上述損傷胡蘿卜放入裝有45 ℃熱水的恒溫水浴鍋中浸泡5 min（產(chǎn)品體積占總水分體積的比例小于10%），以20 ℃室溫自來(lái)水浸泡作為對(duì)照，取出自然晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（30 cm×40 cm，厚0.02 mm），置于室溫（（20±3）℃、相對(duì)濕度70%～80%）黑暗條件下進(jìn)行愈傷。于愈傷的第0、1、3、5、7天測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜在常溫條件下愈傷7 d即可實(shí)現(xiàn)完全愈傷，傷口處的愈傷組織不再明顯增加，故選擇在第7天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 愈傷效果評(píng)價(jià)

1.3.2.1 質(zhì)量損失率測(cè)定

采用稱質(zhì)量法測(cè)定質(zhì)量損失率，每個(gè)處理用胡蘿卜9個(gè)，重復(fù)3次。

1.3.2.2 病情指數(shù)測(cè)定

參照Yang Ruirui等[5]的方法并作修改。取培養(yǎng)了10 d的B. cinereaPDA平板，用滅菌的涂布器刮取孢子，經(jīng)4 層紗布過(guò)濾后用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)至濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。分別在胡蘿卜愈傷的第0、1、3、5、7天，吸取上述配制好的孢子懸浮液20 μL接種于胡蘿卜傷口處。晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋，置于常溫（（20±3）℃、相對(duì)濕度70%～80%）避光條件下貯藏，接種7 d后統(tǒng)計(jì)各發(fā)病級(jí)別對(duì)應(yīng)的胡蘿卜個(gè)數(shù)，并按下式計(jì)算病情指數(shù)。每個(gè)處理用胡蘿卜9個(gè)，重復(fù)3次。

式中：發(fā)病級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)分為5 級(jí)，其中：4級(jí)，75%＜傷口發(fā)病表面積比例≤100%；3級(jí)，50%＜傷口發(fā)病表面積比例≤75%；2級(jí)，25%＜傷口發(fā)病表面積比例≤50%；1級(jí)，0%＜傷口發(fā)病表面積比例≤25%；0級(jí)，傷口表面不發(fā)病。

1.3.3 聚酚軟木脂及木質(zhì)素沉積觀察

SPP的沉積觀察參照Lulai等[13]的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2～0.3 mm、長(zhǎng)和寬均為1 cm左右的薄片，用蒸餾水沖洗切片表面，置于載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察切片的自發(fā)熒光并拍照。

木質(zhì)素的沉積觀察參照Alba等[14]的方法并作適當(dāng)修改。在垂直傷口表面切出厚度0.2～0.3 mm、長(zhǎng)和寬均為1 cm左右的薄片，蒸餾水沖洗8 遍，置于載玻片上滴加1 g/100 mL間苯三酚及濃鹽酸染色1 min，置于光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

愈傷組織的SPP和木質(zhì)素細(xì)胞層厚度根據(jù)Oirschot等[15]的方法通過(guò)IS Capture圖像軟件進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算。

1.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定時(shí)的樣品處理

參照韓占紅等[16]的方法并作修改。用滅菌的手術(shù)刀取傷口處3 mm深組織，液氮速凍后用研樣機(jī)研為粉狀，裝入50 mL離心管，－80 ℃保存待用。

1.3.5 酶活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的測(cè)定參照Koukol等[17]的方法并作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.8，含40 g/L PVP、0.2 mol/L EDTA、0.05 mol/Lβ-巰基乙醇），冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系包括0.5 mL粗酶液、3 mL硼酸-硼砂緩沖液（50 mmol/L，pH 8.8）和0.5 mLL-苯丙氨酸（0.02 mol/L），混合后以反應(yīng)10 s時(shí)測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度，在37 ℃下水浴1 h后，再次測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度。蒸餾水為對(duì)照，以每小時(shí)吸光度變化度增加0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力的測(cè)定參照Lamb[18]的方法并略作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL提取液（15 mmol/Lβ-巰基乙醇、50 mmol/L pH 8.9 Tris-HCl、4 mmol/L MgCl2、體積分?jǐn)?shù)10%甘油、10 μmol/L亮抑酶肽、5 mmol/L VC、1 mmol/L PMSF、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15% PVPP，冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：2.2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含 8 μmol/L反式肉桂酸、3 μmol/L NADPNa2、6 μmol/L 6-磷酸葡萄糖二鈉，pH 8.9）、0.8 mL 粗酶液。在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以Tris-HCl緩沖液作為對(duì)照。以每小時(shí)吸光度變化增加0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力的測(cè)定參照Voo等[19]的方法并作適當(dāng)修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL提取液，冰浴條件下充分研磨。在4 ℃，10 000 r/min條件下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.45 mL 7.5 μmol/L Mg2+（硫酸鎂或氯化鎂）、0.15 mL 50 nmol/mLp-香豆酸、0.15 mL 2.5 μmol/mL ATP、0.15 mL 38 nmol/mL輔酶A以及0.5 mL粗酶液。40 ℃下反應(yīng)10 min后，立即在333 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以每分鐘吸光度增加0.001為1個(gè)酶活力單位（U）。

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力測(cè)定參照Goffner等[20]的方法并略作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL預(yù)冷的0.1 mmol/L pH 6.25的磷酸鹽緩沖液（含15 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 g/100 mL聚乙二醇、0.1 g PVPP），冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：1.0 mL粗酶液、3 mL反應(yīng)液（含10 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、5 mmol/L反式肉桂酸），37 ℃水浴30 min，加入0.1mL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)（如有沉淀離心除去），以0.2 mL磷酸鹽緩沖液與0.8 mL反應(yīng)液為對(duì)照，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測(cè)定參照Venisse等[21]的方法并略作修改。取冷凍粉末1.0 g，加入1 mL提取緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% PVPP、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）），冰浴條件下充分研磨。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.5 mL粗酶液、3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、200 μL 0.5 mol/L H2O2。以蒸餾水為對(duì)照，在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔15 s記錄一次，連續(xù)測(cè)定2 min。以吸光度每分鐘變化0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/g，結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.6 4種酚酸和3種木質(zhì)素前體物質(zhì)含量的測(cè)定

參照Ayaz等[22]的方法并作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇，40 Hz條件下常溫超聲提取40 min，8 000 r/min離心30 min，重復(fù)2次并收集上清液，用真空冷凍濃縮儀于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。蒸干后，用1 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜備用。采用四元梯度超快速液相色譜分析，色譜條件：Waters Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；無(wú)水甲醇（A）和體積分?jǐn)?shù)1%乙酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0～10 min、30% A+70% B，10～12 min、45% A+55% B，12～15 min、65% A+35% B，15～18 min、30% A+70% B，18～20 min、30% A+70% B，18～20 min、30% A+70% B；流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL?？Х人岷徒孀铀嵩?25 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，阿魏酸在322 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，肉桂酸在276 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，芥子醇和肉桂醇在273 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，松柏醇在263 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。以上物質(zhì)含量單位均為μg/g，結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.7 總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的測(cè)定

總酚和類黃酮的測(cè)定參照Mullins等[23]的方法并作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸與5 mL體積分?jǐn)?shù)70%丙酮，置于低溫（4 ℃）黑暗環(huán)境24 h，8 000 r/min離心30 min，收集上清液為提取液。總酚含量測(cè)定體系：1 mL提取液、2 mL稀釋10 倍的福林-酚試劑、2 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3，5 min后在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以無(wú)水甲醇為對(duì)照。類黃酮含量測(cè)定體系：0.5 mL提取液、0.2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3，常溫反應(yīng)6 min，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4% NaOH溶液，反應(yīng)15 min后，蒸餾水定容至5 mL。以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。總酚和類黃酮含量分別以每100 g鮮樣所含沒(méi)食子酸和兒茶酚質(zhì)量計(jì)，單位μg/100 g。

木質(zhì)素含量的測(cè)定參照Morrison等[24]的方法并做適當(dāng)修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入5 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，10 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，沉淀物用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液沖洗3 遍后再用V（無(wú)水乙醇）∶V（正己烷）=1∶2的混合溶液沖洗3次。置于高于50 ℃烘箱中干燥24 h，干燥物中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%溴化乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒溫水浴 30 min，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸，4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液0.5 mL用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。木質(zhì)素含量每克鮮組織的OD280nm表征。

1.3.8 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定參照Prochazkova等[25]的方法并略修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL冷丙酮，冰浴磨成勻漿，于4 ℃下12 000r/min離心20 min，取上清液。反應(yīng)體系：1 mL上清液、100 μL體積分?jǐn)?shù)20%四氯化鈦溶液（溶劑為濃鹽酸）和200 μL濃氨水。混勻反應(yīng)5 min后4 ℃下8 000 r/min離心15 min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4次以減少色素的干擾，最后將沉淀溶于1.5 mL 1 mmol/L H2SO4溶液中，于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算H2O2含量，單位為μmol/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

上述各項(xiàng)測(cè)定至少重復(fù)3次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水處理對(duì)胡蘿卜愈傷期間質(zhì)量損失率和病情指數(shù)的影響

質(zhì)量損失率和病情指數(shù)是評(píng)價(jià)愈傷效果的重要指標(biāo)。愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜的質(zhì)量損失率均持續(xù)升高，除第1天外，處理組的質(zhì)量損失率顯著低于對(duì)照組，第5天時(shí)低于對(duì)照組21%（P＜0.05）（圖1A）。處理組和對(duì)照組胡蘿卜的病情指數(shù)隨愈傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，處理組的病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組，第3天時(shí)低于對(duì)照組22%（P＜0.05）（圖1B）。質(zhì)量損失率和病情指數(shù)的結(jié)果表明，熱水處理組有效促進(jìn)了胡蘿卜的愈傷。

圖1 熱水處理對(duì)愈傷期間損傷胡蘿卜質(zhì)量損失率（A）和損傷接種胡蘿卜病情指數(shù)（B）的影響Fig. 1 Effect of hot water dipping on mass loss of wounded carrots (A)and disease index (B) of inoculated carrots during wound healing

2.2 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處SPP和木質(zhì)素積累的影響

SPP和木質(zhì)素是傷口處愈傷組織的重要成分。愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜在傷口處的SPP、木質(zhì)素積累量隨愈傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，差異出現(xiàn)在第3天，之后處理組胡蘿卜的積累量均顯著高于對(duì)照組（圖2A、B）。處理組和對(duì)照組胡蘿卜在傷口處的SPP、木質(zhì)素細(xì)胞層厚度隨愈傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，其中處理組的SPP細(xì)胞層厚度在第3天高出對(duì)照組18%（P＜0.05），處理組的木質(zhì)素細(xì)胞層厚度在第5天高出對(duì)照組16%（P＜0.05）（圖2C、D）。上述結(jié)果表明，熱水處理有效促進(jìn)了胡蘿卜傷口處SPP和木質(zhì)素的積累。

圖2 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處SPP、木質(zhì)素積累的影響Fig. 2 Effect of hot water dipping on the accumulation of SPP and lignin at wounded sites of carrots during healing

2.3 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力的影響

苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶活性決定酚類物質(zhì)的生成量。愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜傷口處的PAL活力前期迅速增加，第1天達(dá)到峰值后逐漸降低，處理組胡蘿卜的活力高于對(duì)照組，且在第1、3天具有顯著性差異，第1天時(shí)高出對(duì)照組31%（P＜0.05）（圖3A）。胡蘿卜傷口處的C4H、4CL和CAD活力在愈傷期間均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在第3天達(dá)到峰值，且3 d后處理組整體上顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3B～D）。上述結(jié)果表明，熱水處理激活了胡蘿卜傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD。

圖3 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig. 3 Effect of hot water dipping on the activity of PAL (A), C4H (B) ,4CL (C) and CAD (D) at wound sites of carrots during healing

2.4 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處4種酚酸以及總酚、類黃酮含量的影響

肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸是SPP形成的前體物質(zhì)。愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜的肉桂酸、總酚及類黃酮含量均逐漸上升，處理組胡蘿卜在愈傷中后期這些物質(zhì)的含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖4A、E、F）。愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜的咖啡酸、阿魏酸與芥子酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，處理組胡蘿卜的含量高于對(duì)照組，且在中后期具有顯著性差異（P＜0.05）（圖4B～D）。上述結(jié)果表明，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量，促進(jìn)了總酚及類黃酮的積累。

圖4 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處肉桂酸（A）、咖啡酸（B）、阿魏酸（C）、芥子酸（D）、總酚（E）和類黃酮（F）含量的影響Fig. 4 Effect of hot water dipping on the contents of ferulic acid (A),coffeic acid(B), ferulic acid (C), cinnamic acidsinapic acid (D), total phenolics (E) and flavonoids (F) at wound sites of carrots during healing

2.5 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處3種木質(zhì)素單體及木質(zhì)素含量的影響

肉桂醇、松柏醇、芥子醇是木質(zhì)素單體，愈傷期間，處理組和對(duì)照組胡蘿卜的肉桂醇、芥子醇及木質(zhì)素含量均逐漸增加，處理組胡蘿卜的這3種物質(zhì)含量在愈傷中后期均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖5A、C、D）。處理組和對(duì)照組胡蘿卜的松柏醇含量在愈傷期間呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，處理組胡蘿卜的含量高于對(duì)照組，且在第1、3、7天具有顯著性差異，第3天時(shí)高出對(duì)照組26%（P＜0.05）（圖5B）。上述結(jié)果表明，熱水處理組提高了胡蘿卜傷口處肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素含量。

圖5 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處肉桂醇（A）、松柏醇（B）、芥子醇（C）和木質(zhì)素（D）含量的影響Fig. 5 Effect of hot water dipping on the contents of cinnamyl alcohol (A),coniferyl alcohol (B), sinapyl alcohol (C) and lignin (D) at wound sites of carrots during healing

2.6 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處H2O2含量和POD活力的影響

H2O2含量和POD活力可反映SPP和木質(zhì)素單體的聚合水平。處理組胡蘿卜的H2O2含量在愈傷期間先上升后下降再上升，對(duì)照組胡蘿卜的H2O2含量在愈傷早期有所增加，后趨于平穩(wěn)。除第5天外，處理組胡蘿卜的H2O2含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖6A）。處理組和對(duì)照組胡蘿卜的POD活力在愈傷期間不斷增加，處理組顯著高于對(duì)照組，第1天時(shí)高出對(duì)照組1.75 倍（P＜0.05）（圖6B）。上述結(jié)果表明，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處的H2O2含量和POD活力。

圖6 熱水處理對(duì)胡蘿卜傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的影響Fig. 6 Effect of hot water dipping on H2O2 content (A) and POD activity (B) at wound sites of carrots during healing

2.7 胡蘿卜各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果

為了驗(yàn)證胡蘿卜愈傷過(guò)程中各指標(biāo)間的關(guān)系，選取了具有代表性的質(zhì)量損失率、病情指數(shù)、SPP細(xì)胞層厚度、木質(zhì)素細(xì)胞層厚度、總酚和木質(zhì)素含量6個(gè)指標(biāo)，通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析來(lái)明確他們之間的關(guān)系。由表1可知，與胡蘿卜愈傷相關(guān)的6個(gè)指標(biāo)間均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。其中，質(zhì)量損失率（r=0.904）、SPP細(xì)胞層厚度（r=0.928）及木質(zhì)素細(xì)胞層厚度（r=0.945）與總酚含量呈極顯著正相關(guān)，這些指標(biāo)與木質(zhì)素含量也呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.771、0.896、0.911）。而病情指數(shù)與總酚含量（r=－0.952）和木質(zhì)素含量（r=－0.974）呈極顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，熱水處理對(duì)促進(jìn)損傷胡蘿卜的愈合具有重要意義，提高了損傷胡蘿卜對(duì)病原菌的抗性。

以上結(jié)果均為現(xiàn)象指標(biāo)，應(yīng)進(jìn)一步研究愈傷相關(guān)通路（如文中提出的苯丙烷代謝）基因或蛋白水平變化結(jié)果，才更能闡釋熱水處理的加速愈合機(jī)制。

表1 胡蘿卜愈傷效果與總酚和木質(zhì)素含量之間的關(guān)系Table 1 Relationship between wound healing indexes and the contents of total phenolics and lignin in carrots

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，熱水處理可有效降低損傷胡蘿卜愈傷期間的質(zhì)量損失率（圖1A），該結(jié)果與熱水處理降低馬鈴薯愈傷期間質(zhì)量損失率的結(jié)果[5]類似。熱水處理減少胡蘿卜質(zhì)量損失的原因可能是處理組激活了苯丙烷代謝，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。而酚類物質(zhì)是SPP和木質(zhì)素的合成底物，隨著SPP與木質(zhì)素在傷口表面的聚合，有效阻止了通過(guò)傷口的水分蒸騰[26]。此外，熱水處理還可通過(guò)融化表皮蠟質(zhì)封閉部分氣孔來(lái)減少水分蒸騰[10]。本研究還觀察到，熱水處理有效降低了B. cinerea損傷接種胡蘿卜的病情指數(shù)（圖1B），該結(jié)果與熱水處理降低F. sulphureum損傷接種馬鈴薯塊莖的病情指數(shù)的結(jié)果[5]類似。有報(bào)道表明，熱水處理可以促進(jìn)SPP與木質(zhì)素在傷口表面積累，從而形成物理屏障有效阻止病原菌的侵入[26]。此外，熱水處理還可促進(jìn)具有抗菌活性的多酚和類黃酮合成，激活熱休克蛋白及病程相關(guān)蛋白，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)展[27]。

苯丙烷代謝在愈傷過(guò)程中具有重要作用，既可提供SPP和木質(zhì)素形成的底物，又可形成具有抗菌和抗氧化功能的多酚和黃酮類物質(zhì)[28]。PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，參與第一步反應(yīng)，將L-苯丙氨酸脫去氨基生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在C4H的作用下羥基化生成香豆酸，香豆酸可在香豆酸-3-羥基化酶作用下生成咖啡酸，咖啡酸通過(guò)氧甲基轉(zhuǎn)移酶作用生成阿魏酸，阿魏酸通過(guò)阿魏酸-5-羥基化酶羥基化生成5-羥基阿魏酸，后者再通過(guò)5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化生成芥子酸[29]。這些酚酸會(huì)被4CL轉(zhuǎn)化成為相應(yīng)的香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA，這些酚酸-CoA在肉桂酰輔酶A還原酶的催化下分別形成香豆醛、芥子醛和松柏醛[30]。然后CAD將這些醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成肉桂醇、松柏醇、芥子醇等木質(zhì)素的底物[31]。本研究觀察到，熱水處理組激活了PAL、C4H、4CL和CAD（圖3A～D），促進(jìn)了肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、總酚和類黃酮的合成（圖4A～F），以及肉桂醇、松柏醇與芥子醇的積累（圖5A～C）。該結(jié)果與熱水處理促進(jìn)馬鈴薯傷口處總酚和類黃酮積累的結(jié)果[5]類似。有研究表明，桃果實(shí)在熱水處理組后會(huì)快速應(yīng)激，PAL基因表達(dá)量迅速上升[32]。因此推測(cè)，熱水處理可能通過(guò)調(diào)控PAL在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)來(lái)促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成。至于熱水處理組如何調(diào)控苯丙烷代謝尚有待進(jìn)一步研究。

SPP和木質(zhì)素是愈傷組織的主要成分。SPP主要由羥基肉桂酸、阿魏酸等酚酸通過(guò)酯鍵和醚鍵連接而成，具有抵抗病原菌侵染的作用[33]。木質(zhì)素主要由松柏醇、芥子醇和肉桂醇通過(guò)碳-碳鍵、醚鍵和酯鍵聚合而成[34]。木質(zhì)素在細(xì)胞壁沉積除可增加其強(qiáng)度、限制病原菌的侵入外，還可毒殺病原物[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱水處理促進(jìn)了胡蘿卜傷口表面SPP和木質(zhì)素的積累（圖2），該結(jié)果與熱水處理促進(jìn)山藥傷口處SPP和木質(zhì)素積累的結(jié)果[6]類似。SPP和木質(zhì)素單體的氧化交聯(lián)均需要POD和H2O2的參與[36]，本研究發(fā)現(xiàn)，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處H2O2含量（圖6A），該結(jié)果與熱水處理提高馬鈴薯傷口處H2O2含量的結(jié)果[5]類似。有研究表明，熱處理可提高表達(dá)水母發(fā)光蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度[37]。而Ca2+可以作為信號(hào)分子激活鈣依賴蛋白激酶（calciumdependent protein kinase，CDPK），CDPK磷酸化位于質(zhì)膜的NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX），NOX轉(zhuǎn)移電子到O2生成O2－·，由于O2－·存活壽命較短，很快又被超氧化物歧化酶歧化成易存活的H2O2[38]。因此推測(cè)，熱處理組胡蘿卜傷口處的H2O2含量升高可能與熱處理組調(diào)節(jié)Ca2+水平激活NOX途徑有關(guān)，但其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究還觀察到，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處的POD活性（圖6B）。該結(jié)果與熱水處理促進(jìn)山藥傷口處POD的積累結(jié)果[6]類似。有研究表明，熱處理可誘導(dǎo)葡萄果實(shí)Hsp70的基因表達(dá)，POD活性也隨之增加[39]。因此，推測(cè)熱處理提高胡蘿卜傷口處POD活性與熱處理組促進(jìn)熱激蛋白相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

4 結(jié) 論

熱水處理可激活胡蘿卜傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD，促進(jìn)肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、總酚及類黃酮，以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素的合成。此外，熱水處理還提高了胡蘿卜傷口處的H2O2含量和POD活性。胡蘿卜傷口處的酚酸和木質(zhì)素單體在H2O2和POD的作用下氧化交聯(lián)，聚合形成的SPP和木質(zhì)素在傷口表面不斷沉積，從而有效降低了胡蘿卜愈傷期間的質(zhì)量損失率和損傷接種的病情指數(shù)，促進(jìn)了胡蘿卜的采后機(jī)械損傷愈傷。