祝競(jìng)芳，湯 靜，游萬(wàn)里，李甜榮，金 鵬，鄭永華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

鮮切果蔬是指對(duì)果蔬進(jìn)行清洗、切分、包裝等處理后得到的輕度加工產(chǎn)品，具有新鮮方便、衛(wèi)生快捷等特點(diǎn)[1]。萵苣（Lactuca sativaL.）口感清新爽脆，富含多種維生素及礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受大家喜愛(ài)[2]。萵苣食用前需要經(jīng)過(guò)削皮切分等一系列處理，因此非常適合進(jìn)行鮮切加工，但鮮切后的萵苣由于遭受機(jī)械損傷，會(huì)發(fā)生一系列不良的生理生化變化，如表面褐變萎蔫、微生物侵染、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失等，導(dǎo)致感官品質(zhì)和商品價(jià)值的下降，貨架期縮短[3]。因此，延緩鮮切萵苣貯藏期間的品質(zhì)劣變是延長(zhǎng)其貯藏期的關(guān)鍵。氯化鈣是鮮切果蔬貯藏中常用的保鮮劑，研究表明，氯化鈣處理可以抑制鮮切果蔬質(zhì)量損失率上升[4]及硬度下降[5]，減少葉綠素及抗壞血酸的損失[6]，延緩褐變的發(fā)生[7]，這說(shuō)明氯化鈣有助于維持鮮切果蔬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，延緩品質(zhì)劣變，但氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非蛋白氨基酸，已被證實(shí)對(duì)人類具有鎮(zhèn)定神經(jīng)、降低血壓、預(yù)防心血管疾病和改善睡眠等多種營(yíng)養(yǎng)保健功效，因而從食物中補(bǔ)充GABA對(duì)人體健康具有重要意義[8-9]。研究表明，正常情況下植物體內(nèi)GABA含量較低[10]，但在遭遇機(jī)械損傷、高溫、低溫等逆境條件時(shí)會(huì)大量累積，以協(xié)助植物體抵抗外界逆境傷害。如擬南芥葉片經(jīng)機(jī)械損傷后GABA迅速累積[11]，芝麻植株經(jīng)熱激后GABA含量增加了20%[12]，楊樹(shù)葉片經(jīng)鹽脅迫后GABA含量增加了2 倍[13]，新鮮茶葉經(jīng)缺氧處理后GABA含量迅速增加至原來(lái)的20 倍[14]。近年來(lái)的研究表明，切割造成的機(jī)械損傷可促進(jìn)鮮切梨[15]、鮮切獼猴桃[16]和鮮切甘藍(lán)[17]等鮮切果蔬產(chǎn)品中GABA的積累，因此應(yīng)用鮮切加工誘導(dǎo)GABA的合成有望成為提高果蔬產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)保健功效的重要手段，是鮮切果蔬加工保鮮技術(shù)研究的發(fā)展方向。本課題組前期研究表明，鮮切處理可促進(jìn)鮮切萵苣絲中酚類物質(zhì)的積累，提高其抗氧化活性[3]，但有關(guān)鮮切和氯化鈣處理對(duì)萵苣品質(zhì)及GABA含量影響的研究還鮮有報(bào)道。綜上，本實(shí)驗(yàn)首先研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣溶液處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間品質(zhì)及GABA含量的影響，在此基礎(chǔ)上從GABA支路及多胺降解途徑探究氯化鈣促進(jìn)GABA積累的機(jī)理，以期為維持鮮切萵苣貯藏品質(zhì)及改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以‘科興11號(hào)’萵苣為試材，選擇大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害和損傷的萵苣，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

氯化鈣、L-谷氨酸、4-氨基丁醛 南京杰汶達(dá)生物科技有限公司；磷酸吡哆醛、氯化鑭、二硫蘇糖醇美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶、谷氨酸脫氫酶上海源葉生物科技有限公司；腐胺、亞精胺、苯甲酰氯、精胺 南京梅林學(xué)海生物科技有限公司；N,N-二甲基苯胺、高氯酸、苯甲基磺酰氟、乙醚 國(guó)藥集團(tuán)南京化學(xué)試劑有限公司；植物GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase，GABA-T）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒南京梅林學(xué)海生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型分光光度計(jì) 上海Mapada儀器有限公司；GL-20G-H型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；CR-400型精密色差儀 日本美能達(dá)公司；1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萵苣處理

將挑選好的萵苣隨機(jī)分成5組，用200 μL/L NaClO消毒液（有效氯質(zhì)量濃度為55 g/L）浸泡2 min,清洗后晾干去皮，用刨絲刀刨成6 cm×0.3 cm×0.2 cm的絲狀，分別用蒸餾水（即對(duì)照組）及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的氯化鈣溶液（分別記為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%氯化鈣處理組）浸泡處理10 min，置于紗布上攤晾15 min后裝至20 cm×12 cm×8 cm塑料保鮮盒中，每盒約100 g，于10 ℃、相對(duì)濕度為85%～90%條件下貯藏，分別于貯藏6、12、24、36和48 h取樣測(cè)定主要品質(zhì)指標(biāo)、GABA含量。本研究中每個(gè)處理均重復(fù)3次。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 色澤

用色差儀測(cè)定L*、a*、b*值，按式（1）計(jì)算色差（ΔE）[18]，褐變指數(shù)以色差來(lái)表征。

1.3.2.2 質(zhì)量損失率

采用稱質(zhì)量法，以測(cè)定時(shí)的質(zhì)量變化量與初始質(zhì)量的比值來(lái)表示質(zhì)量損失率，具體按式（2）計(jì)算。

式中：m1為樣品測(cè)定時(shí)的質(zhì)量；m0為樣品初始（0 h）質(zhì)量。

1.3.2.3 菌落總數(shù)

根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)，單位為CFU/g。

1.3.2.4 抗壞血酸含量

參照文獻(xiàn)[19]，采用鄰菲羅啉比色法測(cè)定樣品中抗壞血酸含量，單位為mg/100 g。

1.3.2.5 葉綠素含量

參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定樣品中葉綠素含量，結(jié)果用mg/100 g表示。

1.3.2.6 硬度

參考文獻(xiàn)[20]，采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)鮮切萵苣硬度進(jìn)行測(cè)定，探頭直徑為5 mm，檢測(cè)參數(shù)：觸發(fā)力0.4 N；檢測(cè)速率1.5 mm/s；測(cè)后速率3 mm/s；壓縮距離2.5 mm。硬度單位為N。

1.3.3 GABA含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21]的方法并稍加修改測(cè)定樣品中GABA含量。稱取2 g樣品，加入5 mL提前預(yù)冷的50 mmol/L氯化鑭溶液研磨，220 r/min振蕩15 min，然后12 000×g離心15 min。取2 mL上清液，加入0.4 mL 1 mol/L KOH溶液，再次振蕩（220 r/min、5min）后12 000×g離心5 min。取0.5 mL上清液，依次加入0.1 mL 1 mol/L KOH溶液、0.1 mL 0.2 mol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH 9.0）、0.8 mL 6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯酚溶液、0.4 mL NaClO消毒液（有效氯質(zhì)量濃度為55 g/L），沸水浴10 min后立即冰浴5 min，加入0.8 mL 60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液終止反應(yīng)，20 ℃水浴15 min后測(cè)定645 nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算GABA含量。

1.3.4 GABA代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果，選取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣處理組樣品進(jìn)行GABA代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.4.1 谷氨酸含量

參考文獻(xiàn)[21]測(cè)定樣品中谷氨酸含量，單位為mg/100 g。

1.3.4.2 谷氨酸脫羧酶活力

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]并稍加修改。稱取1 g樣品，加入2.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 9.1、含10%（體積分?jǐn)?shù)）甘油、1 mmol/L二硫蘇糖醇、0.5 mmol/L磷酸吡哆醛、5 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）研磨，將得到的勻漿4 ℃、12 000×g離心15 min。取0.2 mL上清液，加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 5.8，含40 μmol/L 磷酸吡哆醛、3 mmol/LL-谷氨酸），30 ℃反應(yīng)1 h，再加入0.1 mL 0.5 mol/L三氯乙酸停止反應(yīng)，然后取0.5 mL此混合溶液，按照1.3.3節(jié)的方法測(cè)定GABA含量，以每小時(shí)產(chǎn)生1 μg GABA為1個(gè)酶活力單位（U），GAD活力單位為U/mg。

1.3.4.3 GABA-T活力

GABA-T活力使用植物GABA-T酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定。

1.3.4.4 腐胺、亞精胺和精胺含量

參照文獻(xiàn)[23]測(cè)定樣品中腐胺、亞精胺和精胺含量。稱取1 g樣品，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%高氯酸冰浴研磨，研磨后冰浴提取1 h，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液。取1 mL上清液，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液、10 μL苯甲酰氯，漩渦20 s，37 ℃水浴25 min，再加入2 mL飽和NaCl溶液、2 mL乙醚，漩渦20 s后10 000×g離心5 min，取1 mL醚相氮吹至干，殘留物加800 μL無(wú)水甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用于高效液相色譜儀測(cè)定，根據(jù)3種多胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量。色譜條件：反向C18柱（55 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為65%甲醇-35%水；進(jìn)樣量為2.0 μL；流速為0.3 mL/min；柱溫30 ℃。

1.3.4.5 二胺氧化酶和多胺氧化酶活力

二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[24]并稍加修改。稱取2 g樣品，加入5 mL磷酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 6.5，下同）充分研磨，4 ℃、12 000×g離心30 min后取1 mL上清液，再依次加入2 mL磷酸鈉緩沖溶液、0.2 mL反應(yīng)顯色液（每10 mL中含有1 mg 4-氨基安替吡啉、2.5 μLN,N-二甲基苯胺）、0.1 mL 250 U/mL辣根過(guò)氧化物酶。在上述體系中加入0.5 mL 20 mmol/L腐胺溶液用于測(cè)定DAO活力；加入0.5 mL含20 mmol/L亞精胺、20 mmol/L精胺的溶液測(cè)定PAO活力，25 ℃孵育30 min后測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度，以每分鐘吸光度變化0.001為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4.6 4-氨基丁醛脫氫酶活力

4-氨基丁醛脫氫酶（4-amino aldehyde dehydrogenase，AMADH）活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]，以每分鐘340 nm波長(zhǎng)處吸光度改變0.001為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有含量指標(biāo)結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)，所有酶活力結(jié)果均蛋白質(zhì)量計(jì)，采用SAS 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2020軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣L*、a*、b*值和褐變的影響

經(jīng)切分處理后的萵苣呈綠色，但隨著貯藏期的延長(zhǎng)，表面發(fā)生褐變，顏色變暗，感官品質(zhì)下降。L*、a*、b*值及褐變指數(shù)（以ΔE表征）是反映鮮切萵苣顏色改變的重要指標(biāo)，L*值代表明亮度，a*值代表紅綠度，b*值代表黃藍(lán)度，褐變指數(shù)可以直接反映鮮切果蔬的褐變程度。如圖1A所示，貯藏期間L*值下降，說(shuō)明鮮切萵苣表面顏色逐漸變暗。如圖1B所示，貯藏期間a*值上升，前期a*值為負(fù)，說(shuō)明鮮切萵苣表面仍呈綠色，后期a*值為正，說(shuō)明鮮切萵苣表面綠色褪去，逐漸發(fā)紅。如圖1C所示，鮮切萵苣b*值呈下降趨勢(shì)，前24 h下降迅速，隨后變化緩慢。如圖1D所示，褐變指數(shù)逐漸上升，說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切萵苣的褐變程度逐漸加重。氯化鈣處理后L*值、b*值高于對(duì)照組，a*值及褐變指數(shù)低于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣處理可以抑制L*值、b*值的下降及a*值、褐變指數(shù)的上升，有助于維持鮮切萵苣的外觀色澤，抑制褐變加重，其中，1.0%氯化鈣處理組的褐變指數(shù)在整個(gè)貯藏期間均保持較低水平，48 h后褐變指數(shù)比對(duì)照組減少了26.9%，對(duì)于鮮切萵苣褐變的抑制效果優(yōu)于其他組。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間L*值（A）、a*值（B）、b*值（C）和褐變指數(shù)（D）的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of calcium chloride on L*value (A), a* value (B), b* value (C) and browning index (D)of fresh-cut lettuce during storage

2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣質(zhì)量損失率和菌落總數(shù)的影響

水分損失及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗等都會(huì)導(dǎo)致鮮切萵苣質(zhì)量下降，造成質(zhì)量損失和失鮮。如圖2A所示，貯藏期間鮮切萵苣質(zhì)量損失率呈上升趨勢(shì)，前12 h迅速上升，對(duì)照組貯藏48 h后質(zhì)量損失率接近4%。氯化鈣處理后質(zhì)量損失率上升緩慢，明顯低于對(duì)照組，這說(shuō)明氯化鈣處理可以有效抑制鮮切萵苣的質(zhì)量損失，其中1.0%氯化鈣處理后質(zhì)量損失率最低，貯藏48 h時(shí)比對(duì)照組減少了86.0%，對(duì)鮮切萵苣質(zhì)量的維持效果最佳。

鮮切萵苣經(jīng)切分處理后暴露在空氣中，易受微生物侵染。菌落總數(shù)可以反映鮮切萵苣的食用安全品質(zhì)，菌落總數(shù)越低，食用安全性越高。如圖2B所示，貯藏期間鮮切萵苣的菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì)，前期上升迅速，后期由于微生物自身有害代謝產(chǎn)物的大量積累，生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌落總數(shù)增長(zhǎng)速率逐漸減慢，貯藏48 h后對(duì)照組菌落總數(shù)接近1×105CFU/g。氯化鈣處理后菌落總數(shù)始終低于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣可以減少鮮切萵苣貯藏期間的微生物侵染，提高其食用安全性，其中，1.0%氯化鈣處理后菌落總數(shù)最低，貯藏48 h時(shí)比對(duì)照組減少了17.5%，對(duì)微生物的抑制效果最佳。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間質(zhì)量損失率（A）和菌落總數(shù)（B）的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of calcium chloride on mass loss rate (A) and aerobic plate count (B) of fresh-cut lettuce during storage

2.3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣抗壞血酸和葉綠素含量的影響

抗壞血酸含量是衡量果蔬營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。如圖3A所示，貯藏期間鮮切萵苣抗壞血酸含量總體呈下降趨勢(shì)，前6 h下降迅速，而后逐漸趨于平緩，對(duì)照組貯藏48 h后抗壞血酸含量?jī)H為初始值的59.7%。氯化鈣處理后抗壞血酸含量高于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣可以抑制抗壞血酸含量的下降，其中，0.5%、1.0%氯化鈣處理對(duì)于抑制抗壞血酸損失具有較好的效果。如圖3B所示，貯藏期間鮮切萵苣葉綠素含量在貯藏前期下降迅速，36 h后緩慢下降。氯化鈣處理的鮮切萵苣葉綠素含量一直高于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣可以抑制鮮切萵苣的葉綠素?fù)p失，其中1.0%氯化鈣處理后葉綠素含量最高。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間抗壞血酸含量（A）和葉綠素含量（B）的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of calcium chloride on ascorbic acid content (A) and chlorophyll content (B) of fresh-cut lettuce during storage

2.4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣硬度及GABA含量的影響

水分損失和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致硬度下降，造成組織軟焉，因此硬度是反映鮮切萵苣感官品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖4A所示，貯藏期間鮮切萵苣的硬度呈下降趨勢(shì)，與初始值相比，對(duì)照組貯藏48 h后硬度下降了26.5%。氯化鈣處理組的硬度始終高于對(duì)照組，這說(shuō)明氯化鈣可以延緩鮮切萵苣硬度的下降，其中1.0%氯化鈣處理組硬度高于其他處理組，貯藏前后硬度變化最小，對(duì)鮮切萵苣硬度的維持效果最好。如圖4B所示，貯藏期間鮮切萵苣GABA含量先上升后下降，在12 h時(shí)達(dá)到頂峰，對(duì)照組此時(shí)的GABA含量為初始值的2 倍，貯藏48 h后GABA含量仍高于初始值。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理均可促進(jìn)鮮切萵苣GABA含量上升，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。對(duì)比4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理，1.0%氯化鈣處理后鮮切萵苣GABA含量最高，在12 h時(shí)達(dá)到54.5 mg/100 g，為此時(shí)對(duì)照組的1.4 倍，為初始值的2.9 倍，這說(shuō)明1.0%氯化鈣能最有效地促進(jìn)鮮切萵苣GABA的合成。

上述結(jié)果表明，1.0%氯化鈣能最有效地延緩鮮切萵苣品質(zhì)的下降和誘導(dǎo)GABA的合成，因此選擇1.0%氯化鈣處理進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，探究氯化鈣處理促進(jìn)GABA積累的機(jī)制。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間硬度（A）及GABA含量（B）的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of calcium chloride on hardness (A) and GABA content (B) of fresh-cut lettuce during storage

2.5 氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣GABA支路的影響

GABA支路是植物體內(nèi)合成GABA的主要途徑，谷氨酸在GAD的催化下生成GABA，之后GABA在GABA-T的催化下分解。如圖5A所示，鮮切萵苣貯藏期間谷氨酸含量先下降后上升，24 h時(shí)含量最低，氯化鈣處理組的谷氨酸含量在24 h時(shí)比對(duì)照組低32.3%，且前36 h含量明顯低于對(duì)照組，這說(shuō)明氯化鈣可以促進(jìn)谷氨酸的分解。如圖5B所示，鮮切萵苣貯藏期間GAD活力先上升后下降，12 h時(shí)活力最高，氯化鈣處理組GAD活力明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣可以通過(guò)提高GAD活力促進(jìn)谷氨酸的分解。如圖5C所示，鮮切萵苣貯藏期間GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h時(shí)達(dá)到頂峰，其變化與GAD活力變化一致。貯藏期間氯化鈣處理組的GABA含量明顯高于對(duì)照組,12 h時(shí)比對(duì)照高44.0%，這說(shuō)明氯化鈣可以促進(jìn)GABA的合成。如圖5D所示，鮮切萵苣貯藏期間GABA-T活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，24 h時(shí)達(dá)到頂峰，貯藏48 h后活力低于初始值。在前24 h，氯化鈣處理組的GABA-T活力明顯高于對(duì)照組，這可能是由于氯化鈣處理促進(jìn)了GABA的生成，使反應(yīng)底物GABA的含量增加，導(dǎo)致催化反應(yīng)的GABA-T活力同樣增加。這些結(jié)果表明，氯化鈣可以通過(guò)提高鮮切萵苣GAD活力，促進(jìn)谷氨酸分解，從而促進(jìn)GABA支路合成GABA。

圖5 氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間谷氨酸含量（A）、GAD活力（B）、GABA含量（C）和GABA-T活力（D）的影響Fig. 5 Effects of calcium chloride treatment on glutamic acid content (A),GAD activity (B), GABA content (C) and GABA transaminase activity (D)of fresh-cut lettuce during storage

2.6 氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣多胺降解途徑的影響

多胺降解是植物體內(nèi)另一條合成GABA的途徑，多胺在DAO、PAO、AMADH的共同作用下生成GABA。由于腐胺可轉(zhuǎn)化成亞精胺，亞精胺可轉(zhuǎn)化成精胺，3種多胺的合成及分解代謝之間相互影響，因此多胺含量呈現(xiàn)復(fù)雜的變化。如圖6A～C所示，鮮切萵苣貯藏期間3種多胺的含量均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，前6 h多胺含量急劇下降，貯藏48 h后含量均低于初始值，氯化鈣處理后腐胺、亞精胺、精胺含量低于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣可以促進(jìn)多胺的降解。如圖6D～F所示，貯藏期間DAO、PAO、AMADH活力先上升后下降，DAO及PAO活力在12 h達(dá)到頂峰，AMADH活力在6 h達(dá)到頂峰。貯藏期間處理組的DAO、PAO、AMADH活力均高于對(duì)照組，說(shuō)明氯化鈣處理可以提高DAO、PAO的活力，促進(jìn)多胺降解生成4-氨基丁醛，4-氨基丁醛在AMADH催化作用下進(jìn)一步反應(yīng)生成GABA。這些結(jié)果表明，氯化鈣處理也可以通過(guò)促進(jìn)多胺降解途徑從而促進(jìn)GABA的合成。

圖6 氯化鈣處理對(duì)鮮切萵苣貯藏期間腐胺含量（A）、亞精胺含量（B）、精胺含量（C）、DAO活力（D）、PAO活力（E）和AMADH活力（F）的影響Fig. 6 Effects of calcium chloride treatment on putrescine content (A),spermidine content (B), spermine content (C), DAO activity (D), PAO activity (E) and AMADH activity (F) of fresh-cut lettuce during storage

3 討 論

萵苣經(jīng)切分處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，外流的汁液為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了有利條件，因而易受到微生物污染，導(dǎo)致食用安全性降低；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)與多酚氧化酶接觸，在氧氣作用下生成醌，導(dǎo)致萵苣表面綠色逐漸變暗消失，褐變加重[25]。此外，切割還會(huì)促進(jìn)萵苣硬度下降，表面軟蔫，抗壞血酸損失，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。Ca2+是植物細(xì)胞壁的重要成分，可以與細(xì)胞壁上的果膠分子結(jié)合形成果膠酸鈣，填充因切割受損的細(xì)胞壁間隙，有助于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，因此氯化鈣處理可抑制鮮切果蔬微生物侵染、褐變、軟化等的發(fā)生[7]。對(duì)鮮切果蔬補(bǔ)充外源Ca2+還可以促進(jìn)抗壞血酸的生物合成和循環(huán)再生，改變細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活力，阻止組織液與酶結(jié)合促進(jìn)褐變，提高抗氧化活性，延緩衰老，延長(zhǎng)貯藏期[26-27]。白琳等[6]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈣可以維持鮮切生姜的硬度，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失、抑制褐變的發(fā)生，對(duì)于維持鮮切生姜的品質(zhì)具有顯著效果。葛金玉等[28]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理可以抑制鮮切蘿卜抗壞血酸的損失，延長(zhǎng)貨架期。連文綺等[29]發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理后的鮮切蘋果褐變程度明顯降低。這些研究均表明氯化鈣處理可以改善鮮切果蔬的品質(zhì)，從而延長(zhǎng)貯藏期。本研究表明，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣處理對(duì)延緩鮮切萵苣品質(zhì)下降沒(méi)有明顯影響，這可能是由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低起不到作用，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成鹽害，加速衰老變質(zhì)[30]。而1.0%氯化鈣處理可以有效抑制鮮切萵苣貯藏過(guò)程中質(zhì)量損失率及菌落總數(shù)的上升，抑制硬度下降，減少抗壞血酸及葉綠素的流失，延緩褐變的發(fā)生，改善貯藏品質(zhì)，因而在鮮切萵苣保鮮中有較好的應(yīng)用前景。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，Ca2+通過(guò)與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）特異性結(jié)合，形成Ca2+/CaM復(fù)合體，傳遞鈣信號(hào)，調(diào)節(jié)下游靶蛋白活力，從而調(diào)控各種細(xì)胞反應(yīng)[31]。GABA的合成積累是植物抵抗逆境的表現(xiàn)，可通過(guò)調(diào)控激素的生物合成及活性氧代謝等使植物具有更高的抗逆性[32]。植物體內(nèi)GABA合成途徑主要有兩條，即GABA支路和多胺降解途徑，兩條途徑共同維持植物體內(nèi)GABA的代謝平衡。GABA支路以L-谷氨酸為原料，在GAD的催化下脫羧生成GABA，隨后GABA又在GABA-T催化下分解生成琥珀酸半醛，其中，GAD是該途徑的限速酶，GAD活力受Ca2+控制，Ca2+能與CaM結(jié)合，激活GAD，促進(jìn)GABA的生成[33]。多胺降解途徑以3種多胺為原料，腐胺、亞精胺、精胺在DAO、PAO催化下生成4-氨基丁醛，4-氨基丁醛再經(jīng)AMADH進(jìn)一步催化，生成GABA進(jìn)入GABA支路，其中，DAO、PAO、AMADH是該途徑的關(guān)鍵酶[34]。已有研究表明采用氯化鈣處理可以調(diào)控兩條途徑相關(guān)酶的活力，從而促進(jìn)鮮切果蔬中GABA的積累。如Wang Kaikai等[21]發(fā)現(xiàn)用氯化鈣處理鮮切胡蘿卜絲可以提高其GAD及DAO、PAO活力，促進(jìn)谷氨酸及多胺的分解，促進(jìn)GABA的積累。Chi Zongyu等[15]也發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理鮮切梨可以激活GAD，促進(jìn)谷氨酸分解，有利于GABA的富集。本研究發(fā)現(xiàn)，鮮切萵苣經(jīng)1.0%氯化鈣處理后谷氨酸含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，這可能是由于貯藏前期谷氨酸被迅速消耗用于合成GABA，貯藏后期GABA支路產(chǎn)生的琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量的谷氨酸導(dǎo)致谷氨酸含量上升[35]；多胺含量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，這可能是由于植物遭遇逆境時(shí)會(huì)迅速產(chǎn)生多胺[36]，貯藏前期多胺降解途徑相關(guān)酶活力迅速上升，多胺被大量消耗用于合成GABA，含量呈下降趨勢(shì)，隨后，由于GABA合成速度減慢，多胺消耗減少，逆境脅迫產(chǎn)生的多胺大于消耗，因此多胺含量又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，最終在貯藏后期多胺含量再次下降，這可能因?yàn)榻M織衰老導(dǎo)致多胺產(chǎn)生量減少[37]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%氯化鈣溶液處理的鮮切萵苣在貯藏前期GABA含量迅速上升，并于12 h時(shí)達(dá)到頂峰，而后GABA含量又逐漸下降，這可能是因?yàn)樵谇捌贕ABA的合成大于其降解利用，這與GABA代謝關(guān)鍵酶GAD、PAO、DAO和AMADH等活力的變化趨勢(shì)相一致。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯化鈣處理可通過(guò)提高GABA支路中GAD的活力和多胺降解途徑中DAO、PAO、AMADH的活力促進(jìn)鮮切果蔬GABA合成。

綜上所述，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%氯化鈣溶液處理可以抑制鮮切萵苣貯藏期間質(zhì)量損失率和菌落總數(shù)的上升，減少抗壞血酸及葉綠素的流失，延緩硬度的下降及褐變的發(fā)生，有助于維持鮮切萵苣的品質(zhì)；此外，氯化鈣處理還可提高GABA支路中GAD的活力及多胺降解途徑中DAO、PAO、AMADH的活力，促進(jìn)GABA合成，提升鮮切萵苣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。