牛丕蓮，周學章，白明生

（寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021）

心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的異常增殖和細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的過度沉淀[1]，是多種心血管疾病發(fā)展至終末期的共同病理變化。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是最重要的促纖維化生長因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3亞型[2]。每一種亞型都有其獨特的生物學功能，其中TGF-β1是主要的形式[3-4]。有研究表明，在心肌纖維化期間人體和動物模型中TGF-β1表達明顯增加[4]。TGF-β1可以增強ECM的沉淀和CFs的轉(zhuǎn)分化[5-6]，進而介導心肌纖維化發(fā)生的過程。參與心肌纖維化發(fā)生的信號通路有TGF-β1/Smads信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路和Wnt信號通路等，但TGF-β1/Smads信號通路被認為是心肌纖維化的主要途徑[7]。

寧夏枸杞（Lycium barbarum）是茄科枸杞屬，主要分布在寧夏、內(nèi)蒙古、新疆等地，是藥食兩用食物，具有抗氧化、提高免疫力等生物活性[8]。酚類化合物是枸杞中主要的功能性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其可以抗氧化、治療心血管疾病、預(yù)防癌癥等[9-11]。綠原酸是寧夏枸杞的主要酚類提取物之一，研究發(fā)現(xiàn)綠原酸類具有抗癌、提高免疫力、抗菌等生物學活性[12-14]。但寧夏枸杞中綠原酸對心肌纖維化影響的研究目前鮮見報道。因此本實驗通過用枸杞中分離得到的綠原酸干預(yù)TGF-β1建立的心肌纖維化細胞模型，考察枸杞中分離得到的綠原酸對TGF-β1誘導的小鼠CFs纖維化的影響，分析其在心肌纖維化病變過程中起到的作用，進而為寧夏枸杞中分離得到的綠原酸在心血管類疾病的臨床治療中提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞（Lycium barbarum）于2018年8月10日采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市中寧縣大戰(zhàn)場鎮(zhèn)興業(yè)村四隊，經(jīng)寧夏大學生命科學學院鄭國琦教授進行了鑒定。

CFs于C57BL/6乳鼠出生后1～3 日的心臟組織中分離。

DMEM培養(yǎng)基 上海昱都生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細胞毒性實驗（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、胰蛋白酶 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清 美國Gibco公司；Western blot技術(shù)相關(guān)的抗體賽信通（上海）生物試劑有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒北京麗科生物有限公司；臺盼藍 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超低溫冰箱 日本SANYO電器公司；電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設(shè)備廠；電泳儀、細胞自動計數(shù)儀美國BIO-RAD公司；GE化學發(fā)光檢測儀 美國Promega公司；電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 枸杞中綠原酸的提取分離

取干燥的寧夏枸杞果實5 kg粉碎，用體積分數(shù)80%乙醇浸提3次，合并提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液減壓濃縮干燥，得到乙酸乙酯萃取浸膏260 g，用二氯甲烷-甲醇（10∶0～0∶10，V/V）經(jīng)正向硅膠柱層析進行洗脫，薄層色譜法檢測合并相同洗脫部位，再經(jīng)過MCI柱，半制備高效液相色譜和Sephadex LH-20柱進行純化，得36 mg化合物，通過對綠原酸對照品薄層（V（乙酸乙酯）∶V（甲酸）∶V（蒸餾水）=14∶1∶1）展開檢測及該化合物的波譜數(shù)據(jù)確定該化合物為綠原酸。

1.3.2 小鼠CFs培養(yǎng)

從新生1～3 d的C57BL/6乳鼠中取心尖部位，快速用含雙抗的冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，切成1 mm的小塊，在37 ℃下用0.25%（質(zhì)量分數(shù)，下同）胰蛋白酶消化。消化后，離心（1 500 r/min、5 min）收集細胞，然后在有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)1.5 h后，棄去懸液。然后加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中為已貼壁的CFs繼續(xù)提供營養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下持續(xù)觀察細胞形態(tài)及貼壁狀況，待細胞生長至85%左右時，進行后續(xù)所需實驗。

1.3.3 心肌纖維化細胞模型建立

實驗分為空白組（培養(yǎng)基、CCK-8）、對照組（未處理的細胞、培養(yǎng)基、CCK-8）和模型組（質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1處理的細胞、培養(yǎng)基、CCK-8），細胞培養(yǎng)后調(diào)整濃度至1×105個/mL。將細胞懸液接種于96 孔板中，100 μL/孔，每個樣本設(shè)置3個重復。培養(yǎng)12 h使其充分貼壁于96 孔板后，加入新鮮培養(yǎng)基并予以相對應(yīng)的刺激處理，培養(yǎng)24、48 h。顯微鏡下觀察拍照，記錄細胞形態(tài)變化。棄去舊液加10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，以吸光度表征細胞活力。

1.3.4 CCK-8檢測枸杞中綠原酸對TGF-β1誘導的CFs增殖的抑制作用

取正常培養(yǎng)的CFs，調(diào)整濃度至1×105個/mL。實驗分為空白組、對照組（未處理細胞）、模型組（質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1處理）和綠原酸組（質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1分別和不同質(zhì)量濃度10、20、50 μg/mL綠原酸組合處理）。用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，用于表征細胞活力。細胞活力越大，CFs增殖越快。

1.3.5 膠原蛋白I、III質(zhì)量濃度的測定

CFs分組培養(yǎng)后，收集上清液至無菌離心管中，3 000 r/min離心20 min，收集上清液。設(shè)置空白孔、待測樣品孔。按ELISA試劑盒說明書測定膠原蛋白（collagen，Col）I、Col III的質(zhì)量濃度。

1.3.6 免疫熒光法測定α-平滑肌肌動蛋白的表達

將無菌玻片放入6 孔板中，調(diào)整CFs濃度為5×104個/mL，培養(yǎng)至細胞貼壁后，吸出舊液，用0.01 mol/L pH 7 PBS清洗，先用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗后加100 μL 0.3% TritonX-100破膜處理20 min，PBS再清洗3次，5%牛血清白蛋白封閉20 min，棄上清液，加入α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗（V（抗體）∶V（抗體稀釋液）=1∶500），4 ℃過夜，用PBS清洗，加熒光二抗，室溫孵育，經(jīng)PBS清洗后，取出玻片，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 纖維化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達量測定

通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）檢測纖維化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Snail2、Twist1、Acta2、S100A4和Smad4的mRNA表達情況。CFs分組培養(yǎng)后，使用Trizol法提取CFs中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增目的基因。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，對細胞中Snail1、Snail2、Twist1、Acta2、S100A4和Smad4進行相對定量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.8 Western blot檢測TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達情況

利用全蛋白提取試劑盒中說明書的詳細步驟進行總蛋白提取，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中經(jīng)過上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜的過程將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用一抗Smad2/3、Smad4、P-Smad2、P-Smad3（每種抗體稀釋比例為1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗3次（10 min/次），并與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（V（二抗）∶V（TBST）=1∶5 000）在室溫孵育2 h，TBST緩沖液徹底洗滌。發(fā)光液A、B等體積混合，用于蛋白顯色，放入化學發(fā)光成像儀進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗進行3次重復，采用GraphPad Prism 5軟件中的One-Way ANOVA對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，使用GraphPad Prism 5軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠原代CFs分離培養(yǎng)形態(tài)學觀察結(jié)果

顯微鏡下觀察CFs生長狀況，呈梭形或不規(guī)則多邊形，排列較緊湊，胞質(zhì)透明（圖1）。細胞生長狀態(tài)良好，符合CFs形態(tài)特征。

圖1 小鼠CFs分離培養(yǎng)2、4 d顯微鏡下的照片F(xiàn)ig. 1 Microscope images of mouse CFs in vitro cultured for two and four days

2.2 心肌纖維化細胞模型形態(tài)學觀察結(jié)果

TGF-β1（質(zhì)量濃度10 ng/mL）誘導小鼠CFs，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果顯示誘導24 h后，與對照組相比，模型組CFs形態(tài)開始由梭形、不規(guī)則多邊形變得狹長（圖2A），誘導48 h后，模型組細胞完全變?yōu)楠M長型（圖2B），表明TGF-β1誘導小鼠CFs 48 h可使CFs細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

圖2 TGF-β1誘導CFs建立的心肌纖維化細胞模型形態(tài)Fig. 2 Morphology of TGF-β1-induced CFs

2.3 枸杞中綠原酸對TGF-β1誘導的CFs增殖的影響

如圖3所示，TGF-β1誘導48 h后，與對照組相比，CFs活力高度顯著增加（P＜0.001），證實心肌纖維化細胞模型建立成功。不同質(zhì)量濃度綠原酸作用后，與模型組相比，50 μg/mL綠原酸可高度顯著抑制TGF-β誘導的細胞增殖（P＜0.001）。因此確定綠原酸質(zhì)量濃度50 μg/mL、作用時間48 h用于后續(xù)實驗。

圖3 綠原酸對TGF-β1誘導的CFs增殖的影響Fig. 3 Effect of chlorogenic acid on the proliferation of CFs induced by TGF-β1

2.4 枸杞中綠原酸對CFs Col I、Col III蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，TGF-β1誘導后，CFs Col I、Col III質(zhì)量濃度高度顯著增加（P＜0.001），經(jīng)枸杞中分離得到的綠原酸干預(yù)后，Col I、Col III蛋白質(zhì)量濃度均高度顯著減少（P＜0.001）。

圖4 綠原酸對TGF-β1誘導的CFs Col I、Col III蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of chlorogenic acid on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1

2.5 枸杞中綠原酸對CFs α-SMA表達的影響

如圖5所示，綠原酸組與模型組相比，α-SMA綠色熒光強度明顯減弱。表明枸杞中分離得到的綠原酸對TGF-β1誘導的α-SMA表達有抑制作用。

圖5 綠原酸對TGF-β1誘導的α-SMA蛋白表達的影響（400×）Fig. 5 Effect of chlorogenic acid on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)

2.6 枸杞中綠原酸對TGF-β1誘導的CFs Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和S100A4 mRNA表達水平的影響

為考察枸杞中分離得到的綠原酸對TGF-β1誘導的CFs纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和纖維化蛋白S100A4的mRNA表達影響，進行了qPCR檢測，結(jié)果如圖6所示。與模型組相比，枸杞中分離得到的綠原酸干預(yù)后，細胞中Acta2、Snail1、Snail2、Smad4、Twist1和纖維化蛋白S100A4的mRNA表達水平均高度顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖6 綠原酸對TGF-β1誘導的CFs中Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和S100A4 mRNA表達影響Fig. 6 Effect of chlorogenic acid on the mRNA expression of Acta2,Twist1, Smad4, Snail1, Snail2 and S100A4 in CFs treated with TGF-β1

2.7 枸杞中綠原酸對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

為探究枸杞中分離得到的綠原酸對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響，利用Western blot進行了檢測，結(jié)果如圖7所示。與模型組相比，枸杞中分離得到的綠原酸干預(yù)后，相關(guān)蛋白（Smad4、Smad2/3）及Smad2/3磷酸化水平表達均高度顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖7 綠原酸對TGF-β1誘導的TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig. 7 Effect of chlorogenic acid on TGF-β1/Smads signaling pathwayrelated protein and gene expression in CFs induced by TGF-β1

3 討 論

心臟主要由心肌細胞和非心肌細胞組成，CFs約占非心肌細胞總量的70%。當心臟受傷時，心肌細胞大量壞死，CFs過度增殖，并分化成肌成纖維細胞，進而遷移和集中在心肌損傷區(qū)，產(chǎn)生Col I、Col III和α-SMA[15-17]，同時也會促進纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）的表達，最終導致心肌纖維化的發(fā)生。

TGF-β1/Smads信號通路是導致心肌纖維化發(fā)生的主要信號通路，Smad2和Smad3是促進TGF-β1介導的心肌纖維化的兩個主要下游調(diào)控因子[18-19]。許小琪等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮II A可以抑制TGF-β1誘導的人皮膚成纖維細胞增殖，其機制可能與TGF-β1/Smads通路有關(guān)。Sun Xutao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強心可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路發(fā)揮抗纖維化作用。本研究用TGF-β1誘導CFs纖維化，用TGF-β1刺激CFs 48 h后，α-SMA表達明顯增加，說明TGF-β1可以促進CFs纖維化的發(fā)生。同時也會促進纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子mRNA（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）表達量和TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白及Smad2/3磷酸化水平增加，表明TGF-β1/Smads信號通路被激活。

寧夏枸杞是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有滋補肝腎、益精明目的作用?，F(xiàn)已被用于心臟病、月經(jīng)不調(diào)、高血壓和更年期等疾病的治療[22-24]。張志濤等[25]研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖通過調(diào)節(jié)大鼠肝纖維化微環(huán)境從而延緩肝臟纖維化；Gan Fang等[26]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可以減輕CCl4誘導肝纖維化，其可能的作用機制與Toll樣受體/核因子-κB（Toll-like receptors/nuclear factor，TLRs/NF-κB）信號通路有關(guān)。寧夏枸杞中含有多種酚酸類化合物，綠原酸是其主要活性成分之一，Qin Linhui等[27]研究發(fā)現(xiàn)，用鏈唑霉素誘導小鼠患1型糖尿病，經(jīng)綠原酸治療12周后，綠原酸除了降低血糖外，還抑制了心臟纖維化；Yang Fan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad7信號通路減輕肝纖維化；Wang Yichun等[29]通過博來霉素誘導小鼠肺纖維化，然后用綠原酸進行治療，發(fā)現(xiàn)綠原酸可通過體內(nèi)外抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來抑制肺纖維化。

本研究采用一定質(zhì)量濃度的從寧夏枸杞中分離得到的綠原酸干預(yù)TGF-β1誘導的CFs，與單純用相同濃度TGF-β1誘導CFs相比發(fā)現(xiàn)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)從寧夏枸杞中分離得到的綠原酸可按劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導的CFs的增殖和Col I、Col III和α-SMA的表達，同時也抑制纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）mRNA的表達，因此綠原酸可以抑制CFs的纖維化。該研究還發(fā)現(xiàn)，用一定質(zhì)量濃度綠原酸干預(yù)TGF-β1誘導的CFs后，與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)的蛋白Smad2/3、Smad4等的表達也受到抑制，表明枸杞中綠原酸抑制CFs纖維化的機制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。

本研究表明，從寧夏枸杞中分離得到的綠原酸可以抑制CFs纖維化進程，其作用機制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為寧夏枸杞中分離得到的綠原酸在臨床預(yù)防治療心血管疾病的進展中提供有力的實驗證據(jù)。