張文剛，杜春婷，楊希娟，張 杰，黨 斌

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室，青海 西寧 810016）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是一種藜科藜屬的雙子葉假谷物，原產(chǎn)于安第斯山脈，歷史悠久，現(xiàn)于我國陜西、甘肅、山西、青海、四川、浙江、西藏等地區(qū)均有種植，是公認(rèn)的“糧食之母”和“營養(yǎng)黃金”[1-2]。藜麥營養(yǎng)價值極高，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、皂苷、酚類、不飽和脂肪酸、維生素等生理活性成分，屬于全營養(yǎng)食品，具有改善人體健康和預(yù)防慢性疾病的潛在價值[3]。藜麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達12.9%～16.5%，比大米和玉米高約1 倍，9種人體必需氨基酸齊全，尤其富含一般谷物中缺乏的限制性氨基酸賴氨酸[4]。藜麥蛋白質(zhì)主要由37%的11S球蛋白和35%的2S清蛋白組成，二硫鍵是穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，而谷蛋白和醇溶蛋白較少[5]。藜麥作為優(yōu)質(zhì)蛋白的來源并不含麩質(zhì)，是加工無麩質(zhì)食品的理想原料之一，近些年來在健康食品開發(fā)及功能因子的挖掘上廣受歡迎[6]。

我國對藜麥的研究集中在育種栽培及初加工方面，例如營養(yǎng)品質(zhì)評價、皂苷和多酚提取、蛋白質(zhì)制備與性質(zhì)研究等，開發(fā)產(chǎn)品包括藜麥面條、餅干、酸奶、酒、糕點、面包、方便米飯等[7-8]。蛋白質(zhì)是藜麥中含量僅次于淀粉的主要營養(yǎng)成分，研究表明，加工對谷物蛋白結(jié)構(gòu)和功能有顯著影響，蛋白的特性很大程度影響食品的工藝、營養(yǎng)與感官[9-11]。延莎等指出濕熱處理可影響藜麥蛋白質(zhì)的水合性質(zhì)、表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性[12]；張婷等采用擠壓膨化改性藜麥粉并分析其品質(zhì)，結(jié)果顯示膨化后藜麥粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由15.09%降低至12.44%，氨基酸組成未改變，但各氨基酸含量有不同程度的下降[13]；蘇艷玲等探究了萌發(fā)對藜麥營養(yǎng)物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)藜麥蛋白質(zhì)含量隨著萌發(fā)時間（0～3 d）的延長呈增加趨勢，該過程伴隨新蛋白質(zhì)的合成，可改善藜麥的營養(yǎng)狀態(tài)及食品品質(zhì)[14]。

目前，藜麥加工基礎(chǔ)理論相較薄弱，對不同處理藜麥主要營養(yǎng)成分的變化缺乏系統(tǒng)探討。因此本研究以‘青白藜1號’為原料，采用蒸煮、萌發(fā)和擠壓膨化處理藜麥并提取藜麥蛋白質(zhì)，分析不同加工方式對藜麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的影響，以期為藜麥及其蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘青白藜1號’藜麥由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物所提供。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、脲 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、牛血清白蛋白（bovine serum protein，BSA）美國Sigma公司；電泳制膠液、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、Tris-甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R250、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨、蛋白Marker（分子質(zhì)量11～245 kD）等為電泳級 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、甲醇、乙酸、鹽酸 天津富宇精細(xì)化工有限公司；大豆色拉油金龍魚糧油食品股份有限公司；實驗用水為去離子水，除說明外其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW200型高速中藥粉碎機 天津鑫華儀器廠；N4S型紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；KETSE 20/40D雙螺桿擠壓膨化機 德國布拉本德公司；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR） 美國熱電公司；FJ 200型高速分散均質(zhì)器 金壇市金城國勝實驗儀器廠；DSC200F3型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 德國耐馳公司；TGL-20M型高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-3C型pH計上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 藜麥處理及樣品制備

藜麥原料經(jīng)除雜、清洗后用于后續(xù)不同處理。對照組藜麥45 ℃烘干后粉碎過100目篩；蒸煮組藜麥均勻鋪在雙層紗布上，于蒸鍋中95 ℃常壓蒸煮5 min，冷卻后冷凍（－50 ℃）干燥20 h，粉碎后過100目篩；萌發(fā)組藜麥用去離子水浸泡6 h，瀝干水后均勻鋪在雙層濾紙培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中暗室發(fā)芽，萌發(fā)48 h，期間每12 h噴灑去離子水，萌發(fā)后冷凍干燥20 h，粉碎后過100目篩；擠壓膨化組取藜麥45 ℃烘干后粉碎過60目篩，所得樣品于六區(qū)溫度150 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min、進料速率15 r/min條件下進行擠壓膨化，膨化物打粉過100目篩。

取上述不同處理下藜麥粉參考文獻[5]提取蛋白質(zhì)，提取過程如下：藜麥粉按照料液比1∶5（m/V）添加正己烷，脫脂2次后揮發(fā)溶劑12 h，按1∶12料液比（m/V）加入水，以1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為11.0，45 ℃下浸提3 h，4 000 r/min離心20 min分離上清液，重復(fù)浸提2次后，合并上清液并以1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5，靜置30 min后4 000 r/min離心收集沉淀，冷凍干燥后即得藜麥蛋白質(zhì)樣品。

1.3.2 溶解度測定

溶解度測定參考文獻[15]并稍作修改。取不同處理藜麥蛋白質(zhì)樣品分別以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度0.2 mg/mL pH值為3.0、5.0、7.0、9.0的藜麥蛋白分散液，室溫攪拌30 min，4 000 r/min離心15 min后取上清液。參考文獻[16]采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白質(zhì)量濃度，按式（1）計算藜麥蛋白溶解度。

1.3.3 乳化特性測定

參考文獻[17]測定蛋白質(zhì)乳化特性。取24 mL藜麥蛋白分散液（2 mg/mL），加入8 mL大豆色拉油，20 000 r/min高速分散均質(zhì)1 min，迅速從樣品底部吸取50 μL乳化液并移入5 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS溶液中，以SDS溶液為對照，測定500 nm波長處吸光度A500nm。乳化液于室溫靜置10 min后，再次按前述方法測得500 nm波長處吸光度A500nm。分別按式（2）、（3）計算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中：DF為稀釋倍數(shù)（100）；ρ為藜麥蛋白分散液質(zhì)量濃度/（g/mL）；p為光程（1 cm）；θ為油的體積占比（0.25）。

式中：EC為0 min時的乳化性/（m2/g）；EC10為10 min后的乳化性/（m2/g）。

1.3.4 起泡性能測定

參考文獻[18]測定蛋白質(zhì)起泡性能。取20 mL藜麥蛋白分散液（2 mg/mL）于50 mL離心管，20 000 r/min高速均質(zhì)1 min，測定泡沫體積。均質(zhì)后樣品靜置1 h，再次測定泡沫體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（4）和（5）計算。

式中：V0為均質(zhì)前藜麥蛋白分散液體積/mL；V為均質(zhì)1 min后的泡沫體積/mL；V60為靜置60 min后泡沫體積/mL。

1.3.5 游離巰基含量測定

參考文獻[19]測定蛋白質(zhì)游離巰基含量。取1 mL藜麥蛋白分散液（1 mg/mL）加入至4 mL反應(yīng)緩沖液（1 mol/L脲、0.001 mol/L EDTA和0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液，pH 8.0），再加入125 μL 0.01 mol/L的DTNB溶液（以0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液配制，pH 8.0），混勻后25 ℃反應(yīng)1 h，結(jié)束后4 000 r/min離心15 min，以反應(yīng)緩沖液為對照測定上清液412 nm波長處吸光度A412nm，按式（6）計算游離巰基含量。

式中：D為稀釋倍數(shù)（5.125）；ρ為藜麥蛋白分散液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 紫外分光光度計、傅里葉紅外光譜儀和差示掃描量熱儀分析

參考文獻[20]分析蛋白質(zhì)的紫外吸收特性、二級結(jié)構(gòu)、變性溫度及焓變值。

以10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液配制1 mg/mL的藜麥蛋白分散液，采用紫外分光光度計掃描200～400 nm范圍內(nèi)樣品紫外吸收光譜。

取一定量藜麥蛋白進行KBr壓片，在400～4 000 cm－1范圍、分辨率4 cm－1條件下利用FTIR掃描樣品，采用Origin 9.1軟件進行分析，計算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量。

取2 mg藜麥蛋白樣品于鋁制坩堝中制樣，以空白坩堝為對照，測定樣品的變性溫度、焓變值（ΔH），掃描溫度20～180 ℃，速率10 ℃/min，氮氣流速20 mL/min。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析藜麥蛋白分子質(zhì)量分布。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，取40 μL藜麥蛋白分散液（1 mg/mL）加入160 μL上樣緩沖液（變性電泳組含5%巰基乙醇），沸水浴5 min。取10 μL處理后的樣品上樣后進行電泳，電泳結(jié)束分離凝膠并置于含有2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）考馬斯亮藍(lán)G250的甲醇-乙酸-水（體積比5∶1∶4）染色液中染色1 h，再用含有12%甲醇和7%乙酸的水溶液脫色，Gel Doc XR+系統(tǒng)成像分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.1軟件作圖，采用Excel 2010軟件和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，采用單因素方差分析中的Duncan’s多重比較進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工方式對藜麥蛋白溶解度的影響

溶解性表現(xiàn)的是蛋白質(zhì)在水相環(huán)境中的分散能力，對蛋白質(zhì)起泡性、乳化性、風(fēng)味等多種功能特性有重要影響[21]。從圖1可以看出，不同方式處理下藜麥蛋白質(zhì)溶解度均隨pH值的增大而顯著增大（P＜0.05）；當(dāng)pH值為3.0～5.0，靠近藜麥蛋白等電點，蛋白質(zhì)溶解度較小，與王棐等[5]的報道一致。pH＞5.0后，藜麥蛋白負(fù)電性增強，靜電斥力增大，溶解度快速升高，pH值為9.0時對照、蒸煮、萌發(fā)和擠壓膨化組藜麥蛋白溶解度均達到最大值，分別為64.25%、50.57%、62.82%和43.10%。與對照組相比，蒸煮與擠壓膨化組藜麥蛋白在不同pH值下的溶解度明顯降低；萌發(fā)藜麥的蛋白質(zhì)溶解度在不同pH值下的變化較小，且當(dāng)pH值為7.0時，相比對照組其溶解度提高了14.12%，表明適度萌發(fā)可以改善藜麥蛋白溶解性。萌發(fā)是種子呼吸代謝的過程，在內(nèi)源酶作用下存在蛋白質(zhì)的分解和新蛋白的合成，而組成和結(jié)構(gòu)改變的蛋白質(zhì)可能具有更好的親水性，因此溶解性提升。蒸煮屬于濕熱加工，在90～100 ℃的較高溫度下，蛋白質(zhì)發(fā)生一定變性，暴露出更多的疏水基團，蛋白之間的相互作用增強，親疏水平衡破壞，因此溶解度降低[12]。擠壓膨化是一個更劇烈的高溫高壓過程，加工藜麥時其蛋白分子展開且部分基團暴露，α-螺旋和β-折疊等二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可能促使表面疏水性增強，機械剪切破壞蛋白高級結(jié)構(gòu)同時，在化學(xué)鍵作用下形成大分子質(zhì)量聚集體，從而大幅降低藜麥蛋白溶解度[22]。

圖1 不同加工方式下藜麥蛋白的溶解性Fig. 1 Effect of different processing methods on solubility of quinoa proteins

2.2 不同加工方式對藜麥蛋白乳化特性的影響

乳化性是指蛋白質(zhì)和油水作用形成乳濁液的能力，而乳化穩(wěn)定性是保持乳濁液狀態(tài)的性能[5]。由圖2可知，不同加工處理下藜麥蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性存在顯著差異（P＜0.05）。各加工方式下乳化性由高到低依次為對照＞擠壓膨化＞萌發(fā)＞蒸煮，擠壓膨化、萌發(fā)、蒸煮處理組相比對照組乳化性分別損失了7.09%、15.90%和21.28%，即不同處理降低了藜麥蛋白乳化性。蛋白質(zhì)的乳化特性與其表面疏水性、柔順性等多種因素有關(guān)，不同加工方式下蛋白質(zhì)的乳化性可能因蛋白分子質(zhì)量與組成、變性程度、表面基團分布、到達油-水界面的能力、復(fù)合物形成等的變化而出現(xiàn)一定減小[12,23]。萌發(fā)藜麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成改變，疏水性降低，溶解度提高，但能到達油-水界面的蛋白質(zhì)含量可能減少，乳化性降低；蒸煮和擠壓膨化加工藜麥后，其蛋白質(zhì)出現(xiàn)較大程度變性，蛋白質(zhì)分子之間或與其他成分可能進一步相互作用形成復(fù)合物，使乳化性損失[24]。

圖2 不同加工方式下藜麥蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性Fig. 2 Effect of different processing methods on emulsifying capacity and emulsion stability of quinoa proteins

各加工方式下乳化穩(wěn)定性由高到低依次為蒸煮＞萌發(fā)＞擠壓膨化＞對照，蒸煮、萌發(fā)、擠壓膨化處理組分別提高至對照組的2.03、1.43、1.08 倍，表明加工處理可以改善藜麥蛋白的乳化穩(wěn)定性。萌發(fā)藜麥蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下，界面特性部分改變，一些新蛋白或蛋白亞基在油-水界面上相互作用更緊密，界面強度提高，使乳化穩(wěn)定性改善[25]。研究指出，適當(dāng)?shù)臒崽幚碛兄诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，暴露更多疏水氨基酸，蛋白質(zhì)表面活性及柔性增強，而且可能形成一些蛋白質(zhì)聚合物，這些有助于改善乳化穩(wěn)定性[26]；因此，實驗中觀察到蒸煮和擠壓膨化處理組藜麥蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性不同程度提高，且濕熱蒸煮影響大于低水分?jǐn)D壓膨化加工。乳化特性越好，蛋白與脂肪結(jié)合越好，一般有利于改善肉制品加工特性。

2.3 不同加工方式對藜麥蛋白起泡性能的影響

蛋白質(zhì)的起泡性質(zhì)與蛋白類型、濃度、水合能力、厚度及蛋白質(zhì)膜的流變性等相關(guān)，良好的蛋白質(zhì)起泡特性可賦予食品良好的口感和松軟的結(jié)構(gòu)[27]。由圖3可知，萌發(fā)處理可以顯著提高藜麥蛋白的起泡性（69.58%）和泡沫穩(wěn)定性（67.86%），可能是萌發(fā)時種子蛋白質(zhì)適度水解，形成分子質(zhì)量較小的亞基結(jié)構(gòu)，并伴隨一些新蛋白質(zhì)的合成，可溶性蛋白含量增加，而形成的亞基與新蛋白可能具有更好的空氣-水界面吸附能力或填補界面膜大顆粒蛋白孔隙的能力，從而改善了藜麥蛋白起泡性能[28]。相反，熱處理（蒸煮和擠壓膨化）總體上顯著降低了藜麥蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性（P＜0.05），且擠壓膨化效果更明顯。研究顯示，溫和的熱處理可以改善藜麥蛋白的起泡性能，主要是熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)單體展開并增加柔性，表面疏水性增強，在空氣-水界面上能快速吸附，起泡性上升；而變性蛋白質(zhì)聚集后，在界面膜相互作用形成一個彈性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻止氣泡聚結(jié)，泡沫穩(wěn)定性得以提升[12,20]。然而，過高的溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量變性和不溶組分的高度聚集，界面膜的初始穩(wěn)定性降低，藜麥蛋白的起泡性能出現(xiàn)損失[29]。此外，藜麥蛋白樣品中可能結(jié)合有少量皂苷，而熱處理過程皂苷含量降低，從而使蒸煮和擠壓膨化藜麥蛋白起泡性能降低[25]。

圖3 不同加工方式下藜麥蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig. 3 Effect of different processing methods on foaming capacity and foam stability of quinoa proteins

2.4 不同加工方式對藜麥蛋白質(zhì)變性溫度和焓變的影響

由表1可知，與對照組藜麥蛋白質(zhì)相比，萌發(fā)、蒸煮和擠壓膨化后藜麥的蛋白質(zhì)變性溫度升高，但差異不顯著（P＞0.05）。萌發(fā)組蛋白質(zhì)變性溫度最高，為78.33 ℃，ΔH相比對照組增加了69.66 J/g，表明萌發(fā)組藜麥的蛋白質(zhì)發(fā)生變性所需熱量增加，可能是藜麥萌發(fā)后其蛋白質(zhì)組成改變，新生成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更緊湊。蒸煮組和擠壓膨化組藜麥的蛋白質(zhì)變性溫度也有提高，但ΔH變化不顯著，這可能與藜麥加工后其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變及可溶性/不可溶性大分子聚合物的形成有關(guān)[17]。有研究表明，二級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)聚合物/網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)強度有較大影響，其中β-折疊相對含量增加可以增強蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[30-31]。綜上可知，3種加工方式適當(dāng)處理藜麥可獲得熱穩(wěn)定性更高的改性蛋白質(zhì)。

2.5 不同加工方式對藜麥蛋白游離巰基含量的影響

游離巰基含量是衡量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及氧化程度的重要指標(biāo)。由圖4可知，與對照組（23.21 μmol/g）相比，蒸煮加工藜麥蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著降低，萌發(fā)藜麥與對照組差異不顯著（P＞0.05），而擠壓膨化藜麥蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著升高，分別達到對照、蒸煮和萌發(fā)組的1.43、1.99、1.44 倍。萌發(fā)是高等植物生命活動中物質(zhì)分解與合成代謝活躍的過程，可以改善種子的營養(yǎng)和加工特性，而在此過程中藜麥貯藏蛋白質(zhì)發(fā)生分解且出現(xiàn)新蛋白質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)－SH與－S－S－之間的轉(zhuǎn)變可能保持相對穩(wěn)定[14]，因此游離巰基含量變化不明顯。傳統(tǒng)熱加工蒸煮的升溫方式主要熱傳遞，已有研究表明傳統(tǒng)熱處理會使蛋白質(zhì)聚集，并使游離巰基氧化為二硫鍵從而降低游離巰基含量[32]；從本研究可看出，蒸煮藜麥的蛋白質(zhì)游離巰基含量最低（16.67 μmol/g）。擠壓膨化過程中，在膨化機內(nèi)腔高溫、高壓及強剪切作用下，藜麥蛋白表面電荷重新分布且趨于均一化，蛋白質(zhì)分子間鍵重排使得蛋白質(zhì)聚集、變性和組織化，二硫鍵被部分還原并進一步形成巰基[22]，使其游離巰基含量（33.20 μmol/L）相比對照組提升。

圖4 不同加工方式下藜麥蛋白的游離巰基含量Fig. 4 Effect of different processing methods on free sulfhydryl content of quinoa proteins

2.6 不同加工方式下藜麥蛋白質(zhì)的光譜分析

由圖5A可知，處理前后的藜麥蛋白質(zhì)在260～300 nm附近具有較強紫外吸收，屬于蛋白質(zhì)表面酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的特征吸收（200～400 nm）[33]。與對照組相比，3種加工方式下藜麥蛋白質(zhì)在波長低于270 nm左右的短波紫外區(qū)吸收強度均有所提高，且蒸煮＞擠壓膨化＞萌發(fā)。Tong Ping等[34]指出，傳統(tǒng)熱處理會使蛋白質(zhì)紫外吸收光譜強度增加，與本研究的發(fā)現(xiàn)基本一致，可能是由于蒸煮會使得藜麥中蛋白質(zhì)變性，表面形成了更多的芳香氨基酸。擠壓膨化加工溫度和壓力更高，在強烈機械剪切下蛋白質(zhì)分子展開和重排，形成組織化結(jié)構(gòu)，雖有部分氨基酸可能發(fā)生分解，但總體上蛋白質(zhì)暴露出了更豐富的芳香基團，使得吸光度增強[34]。萌發(fā)是植物的生理代謝過程，無蛋白變性，并產(chǎn)生一些具有不同高級結(jié)構(gòu)的新蛋白，這些蛋白可能具有良好的吸收特性。

圖5 不同加工方式下藜麥蛋白的紫外（A）及紅外（B）光譜圖Fig. 5 Ultraviolet absorption (A) and Fourier transform infrared spectrometer spectra (B) of quinoa proteins with different treatments

FTIR光譜中酰胺I帶（1600～1700 cm－1）和酰胺III帶（1220～1330 cm－1）經(jīng)傅里葉去卷積并轉(zhuǎn)化為二階導(dǎo)圖譜后可分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。在本研究中采用酰胺I帶信息分析α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量的變化，采用酰胺III帶信息輔助分析無規(guī)卷曲相對含量變化。圖5B中，3 300～3 600 cm－1處的強吸收峰表示藜麥蛋白分子間和分子內(nèi)氫鍵及O－H、N－H鍵的伸縮振動，2 929 cm－1處的吸收峰表征C－H鍵的伸縮振動，1 076 cm－1處可能是C－H、C－C、C－O等鍵的吸收[20]。不同加工方式藜麥蛋白紅外光譜特征峰基本一致；與對照組相比，蒸煮和萌發(fā)組差異較小，擠壓膨化組特征峰吸收強度相對較高；擠壓膨化藜麥蛋白在酰胺I帶的吸收峰有藍(lán)移趨勢，且1 076 cm－1處的吸收強度明顯減弱，證實擠壓膨化使蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變性，肽鏈伸展、重排，在暴露出更多基團的同時部分氨基酸分解，變性蛋白可進一步交聯(lián)形成聚集體，這與溶解度、乳化性和起泡性實驗的推測一致。

由表2可知，蒸煮加工時藜麥蛋白相比對照組β-折疊相對含量顯著增加至89.42%，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲相對含量均顯著減?。≒＜0.05），表明蛋白二級結(jié)構(gòu)有序性有所提升并存在其他結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[17]。擠壓膨化藜麥蛋白中只分析出β-折疊的存在，結(jié)構(gòu)上高度有序，可能與高溫、高壓及高剪切條件下藜麥蛋白的變性、重組和組織化有關(guān)。萌發(fā)后藜麥蛋白相比對照組無規(guī)卷曲相對含量減少1.96%，β-折疊相對含量由58.17%減小至52.06%，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量顯著增加（P＜0.05），表明萌發(fā)藜麥蛋白二級結(jié)構(gòu)較為豐富，在蛋白合成和分解代謝中伴隨者二級結(jié)構(gòu)間的轉(zhuǎn)變，且有序性有所提升。研究表明，大豆蛋白質(zhì)中β-轉(zhuǎn)角作為更為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，其比例與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)[35]。萌發(fā)藜麥蛋白β-轉(zhuǎn)角相對含量略有升高，其表面疏水性降低；蒸煮和擠壓膨化藜麥蛋白β-轉(zhuǎn)角相對含量顯著降低（P＜0.05），其表面疏水性明顯升高；而表面疏水性是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能特性的關(guān)鍵。

表2 不同加工方式下藜麥蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 2 Relative contents of secondary structures in quinoa proteins with different treatments

2.7 不同加工方式藜麥蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖6A可知，3種處理藜麥蛋白條帶主要分布在48～63 kDa及小于15 kDa的低分子質(zhì)量區(qū)，其中48～63 kDa之間可能是藜麥蛋白的11S球蛋白，而分子質(zhì)量低于15 kDa的條帶主要是加工前后存在的一些小分子質(zhì)量亞基[5]。與其他處理組相比，蒸煮藜麥蛋白質(zhì)在接近63 kDa處有一明顯蛋白條帶，其次為擠壓膨化藜麥蛋白在此處有一條稍淡的蛋白條帶，推測為蛋白質(zhì)通過二硫鍵（—S—S—）形成的聚合物；此外，不同處理組低分子條帶區(qū)存在差異，萌發(fā)和擠壓膨化組與對照組相比差異相對明顯，可能是蛋白質(zhì)分解形成的一些更小亞結(jié)構(gòu)。巰基乙醇可以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，亞基數(shù)量增多；由圖6B可以看出，與圖6A中相應(yīng)處理的蛋白條帶相比，在還原條件下藜麥蛋白條帶數(shù)量明顯增加，除分子質(zhì)量48～63 kDa和＜15 kDa的組分外，還出現(xiàn)了分子質(zhì)量在20 kDa和30～35 kDa之間的條帶，表明加工前后藜麥蛋白質(zhì)及其聚集體和小分子亞基等的相互作用以—S—S—為主[36]。20 kDa處的條帶在萌發(fā)組最為明顯，其次為對照組和蒸煮組，該堿性亞基與30～35 kDa處的酸性亞基組成了藜麥的11S球蛋白[5]；擠壓膨化組主要為30～35 kDa和11～17 kDa的兩類蛋白亞基，48～63 kDa處的蛋白質(zhì)基本均被巰基乙醇還原，說明蛋白是由一個30～35 kDa的亞基和一個或多個＜15 kDa的小分子亞基組成。分子質(zhì)量小于＜15 kDa的亞基一方面可能來自藜麥2S清蛋白[4]，或加工中由蛋白質(zhì)破壞、分解產(chǎn)生的其他亞結(jié)構(gòu)；不同加工方式影響總體為擠壓膨化＞萌發(fā)＞蒸煮。

圖6 不同加工方式下藜麥蛋白質(zhì)的非還原（A）和還原（B）SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 Non-reduced (A) and reduced (B) SDS-PAGE profiles of quinoa proteins with different treatments

3 結(jié) 論

不同加工方式對藜麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的影響存在差異。萌發(fā)可以使藜麥產(chǎn)生更多蛋白亞基和新蛋白，蛋白二級結(jié)構(gòu)變豐富，疏水性有所降低，溶解性、起泡特性及乳化穩(wěn)定性得到改善，但其乳化性損失15.90%。與萌發(fā)相比，蒸煮使藜麥蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，游離巰基含量減少，β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量增加，蛋白質(zhì)功能性普遍降低，但可以大幅提高藜麥蛋白的乳化穩(wěn)定性。擠壓膨化處理藜麥可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完全轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，游離巰基含量增加至對照組的1.43 倍，疏水性增加，溶解性和起泡特性顯著降低，而乳化特性與對照組接近。3種方式加工藜麥后，其蛋白熱穩(wěn)定性有提升趨勢。藜麥蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布在48～63 kDa和＜15 kDa范圍，萌發(fā)后小分子蛋白組分有所增加，蒸煮和擠壓膨化組蛋白質(zhì)有聚合物形成，蛋白質(zhì)之間的相互作用以二硫鍵為主。萌發(fā)通過改變藜麥蛋白組成來強化其功能，而蒸煮和擠壓膨化則主要影響高級結(jié)構(gòu)、聚集狀態(tài)等改性蛋白質(zhì)。3種加工藜麥的蛋白質(zhì)可根據(jù)功能特征用于不同食品配料。后續(xù)研究需要考慮加工條件對藜麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性的影響，為藜麥?zhǔn)称芳庸ぜ暗鞍踪|(zhì)開發(fā)利用提供依據(jù)。