高 霞，謝亞如，胡 楊，尤 娟，杜紅英，熊善柏，劉 茹

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

肌球蛋白是參與魚糜熱膠凝過程的骨架蛋白，其加熱前良好的分散性是形成凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[1]。肌球蛋白是一種鹽溶性蛋白，通常在較高的鹽濃度（c（NaCl）＞0.3 mol/L）中才能充分溶解，低鹽或過高鹽濃度都不利于肌球蛋白分散[2-3]。近年來，為倡導(dǎo)健康飲食，降低由于過多攝入鹽引發(fā)高血壓和心血管疾病的幾率，生產(chǎn)低鹽魚糜制品成為一種不可避免的趨勢(shì)[4]。在降低鹽含量的同時(shí)，保證肌球蛋白良好的溶解性對(duì)魚糜制品的品質(zhì)提升至關(guān)重要。有學(xué)者研究了L-組氨酸對(duì)低鹽環(huán)境中肌球蛋白溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)L-組氨酸的添加可提高蛋白質(zhì)的親水性，促進(jìn)肌原纖維蛋白溶脹，從而利于肌球蛋白溶出[5-6]。此外，一些新興技術(shù)如微波[7]、超高壓[8-9]、超聲波[10]等方法因能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分子解聚集，提高其溶解性而被廣泛研究。超聲波作為一種綠色能源，具有操作簡單、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)[11-14]，特別是高強(qiáng)度超聲波能夠顯著改善大豆蛋白[15]、乳清蛋白[16-17]等水溶性蛋白質(zhì)的溶解性。高強(qiáng)度超聲處理會(huì)產(chǎn)生空穴效應(yīng)，并伴隨剪切力、微射流等機(jī)械作用，以及誘發(fā)高活性自由基的化學(xué)作用，從而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[18]。研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲處理提高了雞肉肌原纖維蛋白（鹽濃度為0.6 mol/L）的溶解性[19]，且促進(jìn)了肌球蛋白（鹽濃度為0.5 mol/L）中疏水基團(tuán)、巰基等功能性基團(tuán)的暴露與氧化[20]。然而高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白溶解性及理化性質(zhì)的影響鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以鰱魚為原料提取肌球蛋白，將其溶解于不同鹽（NaCl，下同）濃度的緩沖液中，通過研究高強(qiáng)度超聲處理后肌球蛋白溶解度和粒徑的變化，探討高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白聚集體的影響。進(jìn)一步分析低（0.1 mol/L）、中（0.5 mol/L）、高（1.0 mol/L）鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的流變學(xué)行為和活性巰基含量變化，并采用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察肌球蛋白的微觀形貌，以期闡明高強(qiáng)度超聲對(duì)不同鹽環(huán)境下肌球蛋白理化性質(zhì)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）質(zhì)量約為1.5 kg/尾，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。

5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithioobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZEN 3600激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；AR2000ex型動(dòng)態(tài)流變儀 美國TA公司；F-4600型熒光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考高霞等[2]的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白質(zhì)量濃度測定采用Lowry法[21]，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品制備與處理

用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含不同濃度NaCl）將肌球蛋白的鹽濃度分別調(diào)整至0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0 mol/L。分別取25 mL肌球蛋白溶液于50 mL離心管中，用直徑為0.6 cm的桿狀探頭沒入溶液1 cm處理肌球蛋白樣品。為避免蛋白質(zhì)受熱變性，始終將離心管置于冰水浴中。本實(shí)驗(yàn)中超聲處理?xiàng)l件設(shè)置為頻率20 kHz、功率150 W、時(shí)間9 min（為避免探頭損壞，每超聲處理2 s，間歇2 s，總超聲處理時(shí)間包含間歇時(shí)間）。采用量熱法[22]記錄超聲處理過程中的溫度變化，通過公式（1）[13]計(jì)算超聲強(qiáng)度。

式中：P表示超聲強(qiáng)度/（W/cm2）；m表示被超聲溶液質(zhì)量/kg；cp表示被超聲溶液的比熱容/（J/（kg·K））；dT/dt表示溫度隨時(shí)間變化率/（K/s）；S表示超聲發(fā)射面的表面積/cm2。

經(jīng)計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的超聲處理?xiàng)l件對(duì)應(yīng)的超聲強(qiáng)度為32.47 W/cm2。超聲處理結(jié)束后，測定相應(yīng)的理化指標(biāo)，暫時(shí)不用的肌球蛋白置于4 ℃冰箱存放。

1.3.3 溶解度測定

溶解度的測定參考Riebroy等[23]的方法，取5 mL肌球蛋白溶液于50 mL離心管中，然后4 ℃下8 000 r/min離心10 min，上清液中的蛋白質(zhì)量濃度采用Lowry法[21]測定。溶解度以離心后上清液的蛋白質(zhì)量濃度占離心前蛋白質(zhì)量濃度的百分比表示。

1.3.4 粒徑分布與平均粒徑測定

用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L和2.0 mol/L）將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至1 mg/mL。參考Wei Li等[24]的方法并稍作修改，采用激光粒度儀測定肌球蛋白聚集體的平均粒徑及粒徑分布。

1.3.5 靜態(tài)流變學(xué)性能測定

參考謝亞如等[13]的方法測定肌球蛋白靜態(tài)流變學(xué)性能，肌球蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL，采用AR2000ex型動(dòng)態(tài)流變儀在Steady state flow step模式下掃描，測試條件為溫度4 ℃、椎板傾斜角2°、直徑40 mm、載物臺(tái)與椎板間距54 μm。

1.3.6 活性巰基與總巰基含量測定

用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，NaCl濃度分別為0.1、0.5 mol/L和1.0 mol/L）將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至1 mg/mL?；钚詭€基與總巰基含量的測定參考Ellman[25]的方法。測定活性巰基含量時(shí)，向5.5 mL的蛋白溶液中加入100 μL Ellman試劑（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）混合均勻，于4 ℃下放置1 h后測定其在412 nm波長處的吸光度。測定總巰基含量時(shí)，向0.5 mL的蛋白溶液中加入5.0 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含8.0 mol/L尿素、10 mmol/L乙二胺四乙酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%十二烷基硫酸鈉，pH 8.0）混合均勻，再加100 μL Ellman試劑，于40 ℃水浴中保溫25 min，同樣測其在412 nm波長處的吸光度。巰基含量按式（2）計(jì)算。

式中：C0表示巰基含量/（10－4mol/g pro）；A表示412 nm波長處的吸光度；D表示稀釋倍數(shù)；ρ表示蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ε表示摩爾消光系數(shù)/（13 600 L/（mol·cm））；L表示比色皿光程/cm。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Benjakul等[26]的方法測定肌球蛋白的表面疏水性。用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，NaCl濃度分別為0.1、0.5 mol/L和1.0 mol/L）將肌球蛋白質(zhì)量濃度分別調(diào)整至0.001、0.005、0.01、0.04 mg/mL和0.06 mg/mL，加入20 μL含有8 mmol/L ANS的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.0）。反應(yīng)結(jié)束后，采用熒光光度計(jì)在激發(fā)波長364 nm和發(fā)射波長534 nm處測定熒光強(qiáng)度，表面疏水性（S0-ANS）以熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)量濃度曲線的斜率表示。

1.3.8 微觀形貌觀察

參考高霞等[2]的方法并稍作修改，采用CLSM觀察肌球蛋白的微觀形貌。將不同鹽濃度下的肌球蛋白樣品置于暗環(huán)境中染色15 min，結(jié)束后用蒸餾水沖洗剩余染料。使用10×目鏡和60×物鏡觀測，選用熒光模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每次至少3個(gè)平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 8.0軟件作圖，通過SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白溶解度的變化

由圖1可知，對(duì)照組肌球蛋白的溶解度隨鹽濃度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。肌球蛋白是一種鹽溶性蛋白，低鹽濃度（0.1～0.3 mol/L）下主要以粗絲的形式存在[1]，溶解度較低。隨著鹽濃度增大（0.5～1.0 mol/L），電荷屏蔽效應(yīng)使肌球蛋白溶解度增大。然而，鹽濃度過高時(shí)（2.0 mol/L），分散均勻的蛋白質(zhì)間靜電斥力減小，易聚集發(fā)生鹽析效應(yīng)[2]，從而使得溶解度降低。本研究中，鹽濃度為1.0 mol/L時(shí)肌球蛋白的溶解性能最好，溶解度接近100%。

高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的溶解度（鹽濃度1.0 mol/L的除外），其中0.1 mol/L鹽濃度下肌球蛋白的溶解度被提高到對(duì)照組的10 倍左右，接近于0.2 mol/L鹽濃度時(shí)的對(duì)照組溶解度。高強(qiáng)度超聲作用過程中會(huì)引發(fā)空穴效應(yīng)，并伴隨劇烈的剪切力、湍流等現(xiàn)象，推測這些機(jī)械作用能夠打散蛋白質(zhì)聚集體，使肌球蛋白溶出量增多，溶解度升高。鹽濃度為1.0 mol/L時(shí)，超聲組與對(duì)照組的肌球蛋白溶解度均接近100%，無顯著差異（P＞0.05），這說明肌球蛋白在此鹽濃度下溶解效果較好，高強(qiáng)度超聲處理對(duì)其溶解度無顯著影響。

圖1 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度下肌球蛋白溶解度的變化Fig. 1 Effect of HIU on the solubility of myosin with different salt concentrations

2.2 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的粒徑分布情況

為闡明高強(qiáng)度超聲作用下肌球蛋白溶解度變化的原因，進(jìn)一步研究了高強(qiáng)度超聲對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白聚集體尺寸與分布的影響。由圖2A1可知，鹽濃度為0.1 mol/L時(shí)，肌球蛋白聚集體在2 600～5 000 nm范圍出現(xiàn)單一粒徑分布峰，隨著鹽濃度的升高（0.2～0.5 mol/L），樣品出現(xiàn)2～3個(gè)粒徑分布峰，同時(shí)主峰位置向小粒徑方向偏移，粒徑逐漸分布在100～1 000 nm范圍內(nèi)。然而，繼續(xù)增大鹽濃度至1.0 mol/L以上時(shí)，粒徑分布重新向大粒徑方向移動(dòng)，并且在5 000 nm附近觀察到小峰的出現(xiàn)。有研究認(rèn)為，提純的肌球蛋白在最佳溶解環(huán)境中（0.5 mol/L）仍然以8～20個(gè)肌球蛋白單體組裝的形式存在[27]。當(dāng)鹽濃度偏離0.5 mol/L時(shí)，肌球蛋白粒徑較大，推測這是肌球蛋白中含有的單體數(shù)量增加所致，說明形成了更大的聚集體。由圖2A2可知，高強(qiáng)度超聲作用下低鹽濃度（0.1～0.2 mol/L）環(huán)境中肌球蛋白的粒徑分布峰由對(duì)照組的3 600、1 100 nm分別偏移至2 000、700 nm處，當(dāng)鹽濃度高于0.3 mol/L時(shí)，粒徑分布在10～1 000 nm范圍，且主峰的散射光強(qiáng)度較對(duì)照組有所提高。該結(jié)果說明高強(qiáng)度超聲處理提高了肌球蛋白粒徑分布的均勻性。Tang Ling等[10]曾報(bào)道了類似的現(xiàn)象，13.37 W/cm2超聲處理后羅非魚肌原纖維蛋白的粒徑分布更為均一。由圖2B可以看出，與對(duì)照組相比，高強(qiáng)度超聲處理顯著降低了肌球蛋白的平均粒徑（P＜0.05），尤其0.1 mol/L條件下樣品降低程度最大，說明低鹽環(huán)境中肌球蛋白聚集體的尺寸顯著減小。聚集體尺寸減小有利于增大蛋白質(zhì)與溶劑相接觸的表面積，從而提高了溶解度（圖1）。

圖2 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白粒徑分布（A）與平均粒徑（B）的影響Fig. 2 Effect of HIU on the particle size distribution (A) and average particle size (B) of myosin with different salt concentrations

2.3 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的靜態(tài)流變學(xué)特性

為探究高強(qiáng)度超聲對(duì)肌球蛋白理化特性影響的鹽濃度依賴性，選取低（0.1 mol/L）、中（0.5 mol/L）、高（1.0 mol/L）鹽濃度處理為代表，研究高強(qiáng)度超聲處理前后肌球蛋白樣品的靜態(tài)流變學(xué)性能。在低剪切速率下，剪切應(yīng)力隨剪切速率的升高幾乎呈直線上升的趨勢(shì)（圖3），表現(xiàn)出牛頓流體的性質(zhì)，此階段流體的黏性不受剪切速率的影響，表示為零剪切黏度（η0）[28]。采用Cross模型擬合所得η0見表1。未超聲處理時(shí)，低鹽濃度（0.1 mol/L）下肌球蛋白樣品的η0最大，根據(jù)Wang Guan等[1]的報(bào)道，推測低鹽環(huán)境中肌球蛋白分子間相互作用（氫鍵、離子鍵）較強(qiáng)，從而降低了其流動(dòng)性。鹽濃度增大至0.5、1.0 mol/L，對(duì)照組η0從20.33 Pa·s分別降至0.14、0.13 Pa·s，這是電荷屏蔽效應(yīng)降低了分子間相互作用所致。由表1還可看出，高強(qiáng)度超聲處理明顯降低了肌球蛋白樣品的η0，尤其在低鹽濃度時(shí)降低程度更大，推測高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)及剪切力等機(jī)械作用破壞了肌球蛋白分子間氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵，使其發(fā)生解纏繞，進(jìn)而降低了其黏度。

圖3 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白靜態(tài)流變學(xué)性能變化Fig. 3 Effect of HIU on the static rheological properties of myosin with different salt concentrations

表1 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的模型擬合參數(shù)Table 1 Model fitting parameters of myosin with different salt concentrations treated by HIU

由圖3可知，隨著剪切速率升高，曲線逐漸偏離直線向下彎曲，表現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象，采用冪律模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1。所有樣品的n均小于1，表現(xiàn)出假塑性流體行為。對(duì)照組中，肌球蛋白樣品在中（0.5 mol/L）、高（1.0 mol/L）鹽濃度下n較大，相較于低鹽濃度，其K降低，說明較高鹽濃度（0.5、1.0 mol/L）肌球蛋白樣品的稠度下降、流動(dòng)性增強(qiáng)。高強(qiáng)度超聲處理明顯降低了低鹽濃度肌球蛋白溶液的K，而n高于對(duì)照組，說明高強(qiáng)度超聲處理后肌球蛋白樣品的流動(dòng)性增強(qiáng)。同時(shí)中、高鹽濃度肌球蛋白樣品的稠度和流動(dòng)性經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后變化不大。

2.4 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白巰基含量的變化

由圖4A可知，未超聲處理時(shí)，隨著鹽濃度由0.1 mol/L升高至1.0 mol/L，肌球蛋白活性巰基含量顯著增大（P＜0.05），說明蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了改變，使部分包埋在內(nèi)部的巰基暴露在蛋白質(zhì)表面。鹽濃度為0.1、0.5 mol/L時(shí)，高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的活性巰基含量（P＜0.05），表明高強(qiáng)度超聲處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展。然而，高鹽濃度（1.0 mol/L）下，肌球蛋白的活性巰基含量經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后顯著降低（P＜0.05），這可能與二硫鍵的形成有關(guān)。由圖4B可知，高強(qiáng)度超聲處理顯著降低了肌球蛋白的總巰基含量（0.1 mol/L時(shí)差異不顯著），表明高強(qiáng)度超聲處理可促進(jìn)二硫鍵的形成。高強(qiáng)度超聲過程中水分子降解會(huì)產(chǎn)生高活性自由基（H2O→H·+·OH），促進(jìn)—SH氧化為二硫鍵[29]。類似地，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)150 W超聲處理12 min時(shí)可顯著降低鰱魚肌球蛋白（鹽濃度為0.5 mol/L）的總巰基含量[20]。

圖4 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白活性巰基（A）與總巰基（B）含量的影響Fig. 4 Effect of HIU on the reactive (A) and total (B) sulfhydryl contents of myosin with different salt concentrations

2.5 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白表面疏水性的變化

表面疏水性可用于反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化情況。由圖5可以看出，對(duì)照組肌球蛋白在1.0 mol/L鹽濃度下表面疏水性最大，肌球蛋白分子的疏水性基團(tuán)一般位于尾部的雙螺旋結(jié)構(gòu)中[30]，表面疏水性升高意味著肌球蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)伸展，疏水性基團(tuán)的暴露程度增大。高強(qiáng)度超聲處理對(duì)低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的表面疏水性無顯著影響（P＞0.05），低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白聚集體尺寸較大（圖2），溶解度較低（圖1），進(jìn)一步證明高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的能量主要用于打散蛋白質(zhì)聚集體，而對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象影響較小。鹽濃度為0.5、1.0 mol/L時(shí)，高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的表面疏水性（P＜0.05），肌球蛋白在鹽濃度高于0.5 mol/L時(shí)溶解性較好（圖1），推測高強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大程度伸展，使內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而引起表面疏水性提高。本課題組前期研究表明高強(qiáng)度超聲可誘導(dǎo)肌球蛋白結(jié)構(gòu)中的α-螺旋向較為松散的β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，可促使包埋在內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露出來[13]。

圖5 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Effect of HIU on the surface hydrophobicity of myosin with different salt concentrations

2.6 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的微觀形貌觀察

圖6是高強(qiáng)度超聲處理前后不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的CLSM圖，低鹽環(huán)境（0.1 mol/L）下，肌球蛋白以粗絲形式存在（圖6A1），這解釋了其粒徑較大（圖2）、溶解度低（圖1）的現(xiàn)象。增大鹽濃度時(shí)，肌球蛋白粗絲出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象（圖6B1），鹽離子的電荷屏蔽效應(yīng)增大了蛋白質(zhì)間的空隙，粗絲結(jié)構(gòu)變得均勻。當(dāng)鹽濃度為1.0 mol/L時(shí)，肌球蛋白重新發(fā)生聚集（圖6C1），形成的聚集體較低鹽濃度時(shí)變得均勻，這可能與蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)有關(guān)。該結(jié)果與平均粒徑的變化呈現(xiàn)一致性（圖2）。

相較于中、高鹽濃度，高強(qiáng)度超聲作用下低鹽環(huán)境中肌球蛋白的粗絲結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯斷裂，分散得更加均勻（圖6A2），這與其溶解度升高現(xiàn)象密切相關(guān)。類似地，Tang Ling等[10]研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲作用使低鹽濃度（0.2 mol/L）下肌原纖維蛋白的粗絲結(jié)構(gòu)尺寸減小。此外，1.0 mol/L鹽濃度下高強(qiáng)度超聲處理對(duì)肌球蛋白的微觀形貌無明顯影響，這與溶解度無顯著變化相印證（圖1）。

圖6 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的CLSM圖像（×600）Fig. 6 CLSM images of myosin with different salt concentrations treated by HIU (× 600)

3 討 論

結(jié)合高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白理化指標(biāo)的變化，推測其作用機(jī)理如圖7所示。低鹽濃度環(huán)境中，由于氨基酸側(cè)鏈帶電基團(tuán)的存在，多個(gè)肌球蛋白分子通過弱離子鍵發(fā)生聚集[1]，通過CLSM可觀察到的粗絲結(jié)構(gòu)存在，此時(shí)肌球蛋白聚集體的粒徑較大，溶解性差。高強(qiáng)度超聲作用時(shí)，粗絲結(jié)構(gòu)在空穴效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械力及剪切力等作用下被打散，粒徑顯著降低，增強(qiáng)了與水的相互作用，有利于肌球蛋白溶解度的升高。本研究中肌球蛋白體系的pH值為7.5，高于其等電點(diǎn)（pI 5.5），體系帶有一定量的靜負(fù)電荷[31]。增加鹽濃度時(shí)，Cl－與—NH+3結(jié)合，正電荷被屏蔽，蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷數(shù)量進(jìn)一步增加，靜電斥力增強(qiáng)，粗絲中蛋白質(zhì)間形成較大的空隙，并且暴露出部分活性基團(tuán)。經(jīng)過高強(qiáng)度超聲后蛋白質(zhì)分子更易從粗絲中游離出來，提高分散程度，此外，高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的能量還可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)一步伸展，使原本包埋在螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，這有利于肌球蛋白溶解度的升高。

圖7 高強(qiáng)度超聲對(duì)肌球蛋白理化特性影響的作用機(jī)理Fig. 7 Proposed mechanism of HIU on the physicochemical properties of myosin

4 結(jié) 論

高強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)的肌球蛋白理化性質(zhì)變化受鹽濃度的影響。低鹽濃度（0.1 mol/L）下，高強(qiáng)度超聲處理通過打散肌球蛋白的粗絲結(jié)構(gòu)，提高了蛋白質(zhì)分散程度，使聚集體的平均粒徑顯著下降，肌球蛋白的溶解度增大。高強(qiáng)度超聲處理大幅降低了低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白樣品的η0和K，流動(dòng)性增強(qiáng)。中、高鹽濃度下，肌球蛋白分散均勻，溶解性較好，高強(qiáng)度超聲處理誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變，促進(jìn)了部分活性基團(tuán)的暴露，肌球蛋白的溶解性也有一定程度的提高。相比而言，高強(qiáng)度超聲處理對(duì)中、高鹽濃度肌球蛋白的促溶效果弱于低鹽濃度的。綜上，低鹽濃度下超聲能量主要用于打散肌球蛋白聚集體，而中、高鹽濃度下，超聲能量還會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變。