高 霞,謝亞如,胡 楊,尤 娟,杜紅英,熊善柏,劉 茹
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心,國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢),湖北 武漢 430070)
肌球蛋白是參與魚糜熱膠凝過程的骨架蛋白,其加熱前良好的分散性是形成凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[1]。肌球蛋白是一種鹽溶性蛋白,通常在較高的鹽濃度(c(NaCl)>0.3 mol/L)中才能充分溶解,低鹽或過高鹽濃度都不利于肌球蛋白分散[2-3]。近年來,為倡導(dǎo)健康飲食,降低由于過多攝入鹽引發(fā)高血壓和心血管疾病的幾率,生產(chǎn)低鹽魚糜制品成為一種不可避免的趨勢(shì)[4]。在降低鹽含量的同時(shí),保證肌球蛋白良好的溶解性對(duì)魚糜制品的品質(zhì)提升至關(guān)重要。有學(xué)者研究了L-組氨酸對(duì)低鹽環(huán)境中肌球蛋白溶解性的影響,發(fā)現(xiàn)L-組氨酸的添加可提高蛋白質(zhì)的親水性,促進(jìn)肌原纖維蛋白溶脹,從而利于肌球蛋白溶出[5-6]。此外,一些新興技術(shù)如微波[7]、超高壓[8-9]、超聲波[10]等方法因能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分子解聚集,提高其溶解性而被廣泛研究。超聲波作為一種綠色能源,具有操作簡單、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)[11-14],特別是高強(qiáng)度超聲波能夠顯著改善大豆蛋白[15]、乳清蛋白[16-17]等水溶性蛋白質(zhì)的溶解性。高強(qiáng)度超聲處理會(huì)產(chǎn)生空穴效應(yīng),并伴隨剪切力、微射流等機(jī)械作用,以及誘發(fā)高活性自由基的化學(xué)作用,從而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[18]。研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲處理提高了雞肉肌原纖維蛋白(鹽濃度為0.6 mol/L)的溶解性[19],且促進(jìn)了肌球蛋白(鹽濃度為0.5 mol/L)中疏水基團(tuán)、巰基等功能性基團(tuán)的暴露與氧化[20]。然而高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白溶解性及理化性質(zhì)的影響鮮見報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)以鰱魚為原料提取肌球蛋白,將其溶解于不同鹽(NaCl,下同)濃度的緩沖液中,通過研究高強(qiáng)度超聲處理后肌球蛋白溶解度和粒徑的變化,探討高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白聚集體的影響。進(jìn)一步分析低(0.1 mol/L)、中(0.5 mol/L)、高(1.0 mol/L)鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的流變學(xué)行為和活性巰基含量變化,并采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察肌球蛋白的微觀形貌,以期闡明高強(qiáng)度超聲對(duì)不同鹽環(huán)境下肌球蛋白理化性質(zhì)的影響機(jī)制。
鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)質(zhì)量約為1.5 kg/尾,購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。
5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithioobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB) 生工生物工程(上海)股份有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;ZEN 3600激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;AR2000ex型動(dòng)態(tài)流變儀 美國TA公司;F-4600型熒光光度計(jì) 日本日立公司。
1.3.1 肌球蛋白的提取
參考高霞等[2]的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白質(zhì)量濃度測定采用Lowry法[21],用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2 樣品制備與處理
用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5,含不同濃度NaCl)將肌球蛋白的鹽濃度分別調(diào)整至0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0 mol/L。分別取25 mL肌球蛋白溶液于50 mL離心管中,用直徑為0.6 cm的桿狀探頭沒入溶液1 cm處理肌球蛋白樣品。為避免蛋白質(zhì)受熱變性,始終將離心管置于冰水浴中。本實(shí)驗(yàn)中超聲處理?xiàng)l件設(shè)置為頻率20 kHz、功率150 W、時(shí)間9 min(為避免探頭損壞,每超聲處理2 s,間歇2 s,總超聲處理時(shí)間包含間歇時(shí)間)。采用量熱法[22]記錄超聲處理過程中的溫度變化,通過公式(1)[13]計(jì)算超聲強(qiáng)度。
式中:P表示超聲強(qiáng)度/(W/cm2);m表示被超聲溶液質(zhì)量/kg;cp表示被超聲溶液的比熱容/(J/(kg·K));dT/dt表示溫度隨時(shí)間變化率/(K/s);S表示超聲發(fā)射面的表面積/cm2。
經(jīng)計(jì)算,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的超聲處理?xiàng)l件對(duì)應(yīng)的超聲強(qiáng)度為32.47 W/cm2。超聲處理結(jié)束后,測定相應(yīng)的理化指標(biāo),暫時(shí)不用的肌球蛋白置于4 ℃冰箱存放。
1.3.3 溶解度測定
溶解度的測定參考Riebroy等[23]的方法,取5 mL肌球蛋白溶液于50 mL離心管中,然后4 ℃下8 000 r/min離心10 min,上清液中的蛋白質(zhì)量濃度采用Lowry法[21]測定。溶解度以離心后上清液的蛋白質(zhì)量濃度占離心前蛋白質(zhì)量濃度的百分比表示。
1.3.4 粒徑分布與平均粒徑測定
用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5,NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L和2.0 mol/L)將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至1 mg/mL。參考Wei Li等[24]的方法并稍作修改,采用激光粒度儀測定肌球蛋白聚集體的平均粒徑及粒徑分布。
1.3.5 靜態(tài)流變學(xué)性能測定
參考謝亞如等[13]的方法測定肌球蛋白靜態(tài)流變學(xué)性能,肌球蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL,采用AR2000ex型動(dòng)態(tài)流變儀在Steady state flow step模式下掃描,測試條件為溫度4 ℃、椎板傾斜角2°、直徑40 mm、載物臺(tái)與椎板間距54 μm。
1.3.6 活性巰基與總巰基含量測定
用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5,NaCl濃度分別為0.1、0.5 mol/L和1.0 mol/L)將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至1 mg/mL?;钚詭€基與總巰基含量的測定參考Ellman[25]的方法。測定活性巰基含量時(shí),向5.5 mL的蛋白溶液中加入100 μL Ellman試劑(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl,pH 6.8)混合均勻,于4 ℃下放置1 h后測定其在412 nm波長處的吸光度。測定總巰基含量時(shí),向0.5 mL的蛋白溶液中加入5.0 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(含8.0 mol/L尿素、10 mmol/L乙二胺四乙酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%十二烷基硫酸鈉,pH 8.0)混合均勻,再加100 μL Ellman試劑,于40 ℃水浴中保溫25 min,同樣測其在412 nm波長處的吸光度。巰基含量按式(2)計(jì)算。
式中:C0表示巰基含量/(10-4mol/g pro);A表示412 nm波長處的吸光度;D表示稀釋倍數(shù);ρ表示蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL);ε表示摩爾消光系數(shù)/(13 600 L/(mol·cm));L表示比色皿光程/cm。
1.3.7 表面疏水性測定
參考Benjakul等[26]的方法測定肌球蛋白的表面疏水性。用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5,NaCl濃度分別為0.1、0.5 mol/L和1.0 mol/L)將肌球蛋白質(zhì)量濃度分別調(diào)整至0.001、0.005、0.01、0.04 mg/mL和0.06 mg/mL,加入20 μL含有8 mmol/L ANS的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH 7.0)。反應(yīng)結(jié)束后,采用熒光光度計(jì)在激發(fā)波長364 nm和發(fā)射波長534 nm處測定熒光強(qiáng)度,表面疏水性(S0-ANS)以熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)量濃度曲線的斜率表示。
1.3.8 微觀形貌觀察
參考高霞等[2]的方法并稍作修改,采用CLSM觀察肌球蛋白的微觀形貌。將不同鹽濃度下的肌球蛋白樣品置于暗環(huán)境中染色15 min,結(jié)束后用蒸餾水沖洗剩余染料。使用10×目鏡和60×物鏡觀測,選用熒光模式。
所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),每次至少3個(gè)平行,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 8.0軟件作圖,通過SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中方差分析法進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05表示差異顯著。
由圖1可知,對(duì)照組肌球蛋白的溶解度隨鹽濃度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。肌球蛋白是一種鹽溶性蛋白,低鹽濃度(0.1~0.3 mol/L)下主要以粗絲的形式存在[1],溶解度較低。隨著鹽濃度增大(0.5~1.0 mol/L),電荷屏蔽效應(yīng)使肌球蛋白溶解度增大。然而,鹽濃度過高時(shí)(2.0 mol/L),分散均勻的蛋白質(zhì)間靜電斥力減小,易聚集發(fā)生鹽析效應(yīng)[2],從而使得溶解度降低。本研究中,鹽濃度為1.0 mol/L時(shí)肌球蛋白的溶解性能最好,溶解度接近100%。
高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的溶解度(鹽濃度1.0 mol/L的除外),其中0.1 mol/L鹽濃度下肌球蛋白的溶解度被提高到對(duì)照組的10 倍左右,接近于0.2 mol/L鹽濃度時(shí)的對(duì)照組溶解度。高強(qiáng)度超聲作用過程中會(huì)引發(fā)空穴效應(yīng),并伴隨劇烈的剪切力、湍流等現(xiàn)象,推測這些機(jī)械作用能夠打散蛋白質(zhì)聚集體,使肌球蛋白溶出量增多,溶解度升高。鹽濃度為1.0 mol/L時(shí),超聲組與對(duì)照組的肌球蛋白溶解度均接近100%,無顯著差異(P>0.05),這說明肌球蛋白在此鹽濃度下溶解效果較好,高強(qiáng)度超聲處理對(duì)其溶解度無顯著影響。
圖1 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度下肌球蛋白溶解度的變化Fig. 1 Effect of HIU on the solubility of myosin with different salt concentrations
為闡明高強(qiáng)度超聲作用下肌球蛋白溶解度變化的原因,進(jìn)一步研究了高強(qiáng)度超聲對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白聚集體尺寸與分布的影響。由圖2A1可知,鹽濃度為0.1 mol/L時(shí),肌球蛋白聚集體在2 600~5 000 nm范圍出現(xiàn)單一粒徑分布峰,隨著鹽濃度的升高(0.2~0.5 mol/L),樣品出現(xiàn)2~3個(gè)粒徑分布峰,同時(shí)主峰位置向小粒徑方向偏移,粒徑逐漸分布在100~1 000 nm范圍內(nèi)。然而,繼續(xù)增大鹽濃度至1.0 mol/L以上時(shí),粒徑分布重新向大粒徑方向移動(dòng),并且在5 000 nm附近觀察到小峰的出現(xiàn)。有研究認(rèn)為,提純的肌球蛋白在最佳溶解環(huán)境中(0.5 mol/L)仍然以8~20個(gè)肌球蛋白單體組裝的形式存在[27]。當(dāng)鹽濃度偏離0.5 mol/L時(shí),肌球蛋白粒徑較大,推測這是肌球蛋白中含有的單體數(shù)量增加所致,說明形成了更大的聚集體。由圖2A2可知,高強(qiáng)度超聲作用下低鹽濃度(0.1~0.2 mol/L)環(huán)境中肌球蛋白的粒徑分布峰由對(duì)照組的3 600、1 100 nm分別偏移至2 000、700 nm處,當(dāng)鹽濃度高于0.3 mol/L時(shí),粒徑分布在10~1 000 nm范圍,且主峰的散射光強(qiáng)度較對(duì)照組有所提高。該結(jié)果說明高強(qiáng)度超聲處理提高了肌球蛋白粒徑分布的均勻性。Tang Ling等[10]曾報(bào)道了類似的現(xiàn)象,13.37 W/cm2超聲處理后羅非魚肌原纖維蛋白的粒徑分布更為均一。由圖2B可以看出,與對(duì)照組相比,高強(qiáng)度超聲處理顯著降低了肌球蛋白的平均粒徑(P<0.05),尤其0.1 mol/L條件下樣品降低程度最大,說明低鹽環(huán)境中肌球蛋白聚集體的尺寸顯著減小。聚集體尺寸減小有利于增大蛋白質(zhì)與溶劑相接觸的表面積,從而提高了溶解度(圖1)。
圖2 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白粒徑分布(A)與平均粒徑(B)的影響Fig. 2 Effect of HIU on the particle size distribution (A) and average particle size (B) of myosin with different salt concentrations
為探究高強(qiáng)度超聲對(duì)肌球蛋白理化特性影響的鹽濃度依賴性,選取低(0.1 mol/L)、中(0.5 mol/L)、高(1.0 mol/L)鹽濃度處理為代表,研究高強(qiáng)度超聲處理前后肌球蛋白樣品的靜態(tài)流變學(xué)性能。在低剪切速率下,剪切應(yīng)力隨剪切速率的升高幾乎呈直線上升的趨勢(shì)(圖3),表現(xiàn)出牛頓流體的性質(zhì),此階段流體的黏性不受剪切速率的影響,表示為零剪切黏度(η0)[28]。采用Cross模型擬合所得η0見表1。未超聲處理時(shí),低鹽濃度(0.1 mol/L)下肌球蛋白樣品的η0最大,根據(jù)Wang Guan等[1]的報(bào)道,推測低鹽環(huán)境中肌球蛋白分子間相互作用(氫鍵、離子鍵)較強(qiáng),從而降低了其流動(dòng)性。鹽濃度增大至0.5、1.0 mol/L,對(duì)照組η0從20.33 Pa·s分別降至0.14、0.13 Pa·s,這是電荷屏蔽效應(yīng)降低了分子間相互作用所致。由表1還可看出,高強(qiáng)度超聲處理明顯降低了肌球蛋白樣品的η0,尤其在低鹽濃度時(shí)降低程度更大,推測高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)及剪切力等機(jī)械作用破壞了肌球蛋白分子間氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵,使其發(fā)生解纏繞,進(jìn)而降低了其黏度。
圖3 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白靜態(tài)流變學(xué)性能變化Fig. 3 Effect of HIU on the static rheological properties of myosin with different salt concentrations
表1 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的模型擬合參數(shù)Table 1 Model fitting parameters of myosin with different salt concentrations treated by HIU
由圖3可知,隨著剪切速率升高,曲線逐漸偏離直線向下彎曲,表現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象,采用冪律模型進(jìn)行擬合,結(jié)果見表1。所有樣品的n均小于1,表現(xiàn)出假塑性流體行為。對(duì)照組中,肌球蛋白樣品在中(0.5 mol/L)、高(1.0 mol/L)鹽濃度下n較大,相較于低鹽濃度,其K降低,說明較高鹽濃度(0.5、1.0 mol/L)肌球蛋白樣品的稠度下降、流動(dòng)性增強(qiáng)。高強(qiáng)度超聲處理明顯降低了低鹽濃度肌球蛋白溶液的K,而n高于對(duì)照組,說明高強(qiáng)度超聲處理后肌球蛋白樣品的流動(dòng)性增強(qiáng)。同時(shí)中、高鹽濃度肌球蛋白樣品的稠度和流動(dòng)性經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后變化不大。
由圖4A可知,未超聲處理時(shí),隨著鹽濃度由0.1 mol/L升高至1.0 mol/L,肌球蛋白活性巰基含量顯著增大(P<0.05),說明蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了改變,使部分包埋在內(nèi)部的巰基暴露在蛋白質(zhì)表面。鹽濃度為0.1、0.5 mol/L時(shí),高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的活性巰基含量(P<0.05),表明高強(qiáng)度超聲處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展。然而,高鹽濃度(1.0 mol/L)下,肌球蛋白的活性巰基含量經(jīng)高強(qiáng)度超聲處理后顯著降低(P<0.05),這可能與二硫鍵的形成有關(guān)。由圖4B可知,高強(qiáng)度超聲處理顯著降低了肌球蛋白的總巰基含量(0.1 mol/L時(shí)差異不顯著),表明高強(qiáng)度超聲處理可促進(jìn)二硫鍵的形成。高強(qiáng)度超聲過程中水分子降解會(huì)產(chǎn)生高活性自由基(H2O→H·+·OH),促進(jìn)—SH氧化為二硫鍵[29]。類似地,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)150 W超聲處理12 min時(shí)可顯著降低鰱魚肌球蛋白(鹽濃度為0.5 mol/L)的總巰基含量[20]。
圖4 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白活性巰基(A)與總巰基(B)含量的影響Fig. 4 Effect of HIU on the reactive (A) and total (B) sulfhydryl contents of myosin with different salt concentrations
表面疏水性可用于反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化情況。由圖5可以看出,對(duì)照組肌球蛋白在1.0 mol/L鹽濃度下表面疏水性最大,肌球蛋白分子的疏水性基團(tuán)一般位于尾部的雙螺旋結(jié)構(gòu)中[30],表面疏水性升高意味著肌球蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)伸展,疏水性基團(tuán)的暴露程度增大。高強(qiáng)度超聲處理對(duì)低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的表面疏水性無顯著影響(P>0.05),低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白聚集體尺寸較大(圖2),溶解度較低(圖1),進(jìn)一步證明高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的能量主要用于打散蛋白質(zhì)聚集體,而對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象影響較小。鹽濃度為0.5、1.0 mol/L時(shí),高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的表面疏水性(P<0.05),肌球蛋白在鹽濃度高于0.5 mol/L時(shí)溶解性較好(圖1),推測高強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大程度伸展,使內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露,從而引起表面疏水性提高。本課題組前期研究表明高強(qiáng)度超聲可誘導(dǎo)肌球蛋白結(jié)構(gòu)中的α-螺旋向較為松散的β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,可促使包埋在內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露出來[13]。
圖5 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同鹽濃度下肌球蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Effect of HIU on the surface hydrophobicity of myosin with different salt concentrations
圖6是高強(qiáng)度超聲處理前后不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的CLSM圖,低鹽環(huán)境(0.1 mol/L)下,肌球蛋白以粗絲形式存在(圖6A1),這解釋了其粒徑較大(圖2)、溶解度低(圖1)的現(xiàn)象。增大鹽濃度時(shí),肌球蛋白粗絲出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象(圖6B1),鹽離子的電荷屏蔽效應(yīng)增大了蛋白質(zhì)間的空隙,粗絲結(jié)構(gòu)變得均勻。當(dāng)鹽濃度為1.0 mol/L時(shí),肌球蛋白重新發(fā)生聚集(圖6C1),形成的聚集體較低鹽濃度時(shí)變得均勻,這可能與蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)有關(guān)。該結(jié)果與平均粒徑的變化呈現(xiàn)一致性(圖2)。
相較于中、高鹽濃度,高強(qiáng)度超聲作用下低鹽環(huán)境中肌球蛋白的粗絲結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯斷裂,分散得更加均勻(圖6A2),這與其溶解度升高現(xiàn)象密切相關(guān)。類似地,Tang Ling等[10]研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲作用使低鹽濃度(0.2 mol/L)下肌原纖維蛋白的粗絲結(jié)構(gòu)尺寸減小。此外,1.0 mol/L鹽濃度下高強(qiáng)度超聲處理對(duì)肌球蛋白的微觀形貌無明顯影響,這與溶解度無顯著變化相印證(圖1)。
圖6 高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白的CLSM圖像(×600)Fig. 6 CLSM images of myosin with different salt concentrations treated by HIU (× 600)
結(jié)合高強(qiáng)度超聲作用下不同鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白理化指標(biāo)的變化,推測其作用機(jī)理如圖7所示。低鹽濃度環(huán)境中,由于氨基酸側(cè)鏈帶電基團(tuán)的存在,多個(gè)肌球蛋白分子通過弱離子鍵發(fā)生聚集[1],通過CLSM可觀察到的粗絲結(jié)構(gòu)存在,此時(shí)肌球蛋白聚集體的粒徑較大,溶解性差。高強(qiáng)度超聲作用時(shí),粗絲結(jié)構(gòu)在空穴效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械力及剪切力等作用下被打散,粒徑顯著降低,增強(qiáng)了與水的相互作用,有利于肌球蛋白溶解度的升高。本研究中肌球蛋白體系的pH值為7.5,高于其等電點(diǎn)(pI 5.5),體系帶有一定量的靜負(fù)電荷[31]。增加鹽濃度時(shí),Cl-與—NH+3結(jié)合,正電荷被屏蔽,蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷數(shù)量進(jìn)一步增加,靜電斥力增強(qiáng),粗絲中蛋白質(zhì)間形成較大的空隙,并且暴露出部分活性基團(tuán)。經(jīng)過高強(qiáng)度超聲后蛋白質(zhì)分子更易從粗絲中游離出來,提高分散程度,此外,高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的能量還可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)一步伸展,使原本包埋在螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面,這有利于肌球蛋白溶解度的升高。
圖7 高強(qiáng)度超聲對(duì)肌球蛋白理化特性影響的作用機(jī)理Fig. 7 Proposed mechanism of HIU on the physicochemical properties of myosin
高強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)的肌球蛋白理化性質(zhì)變化受鹽濃度的影響。低鹽濃度(0.1 mol/L)下,高強(qiáng)度超聲處理通過打散肌球蛋白的粗絲結(jié)構(gòu),提高了蛋白質(zhì)分散程度,使聚集體的平均粒徑顯著下降,肌球蛋白的溶解度增大。高強(qiáng)度超聲處理大幅降低了低鹽濃度環(huán)境中肌球蛋白樣品的η0和K,流動(dòng)性增強(qiáng)。中、高鹽濃度下,肌球蛋白分散均勻,溶解性較好,高強(qiáng)度超聲處理誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變,促進(jìn)了部分活性基團(tuán)的暴露,肌球蛋白的溶解性也有一定程度的提高。相比而言,高強(qiáng)度超聲處理對(duì)中、高鹽濃度肌球蛋白的促溶效果弱于低鹽濃度的。綜上,低鹽濃度下超聲能量主要用于打散肌球蛋白聚集體,而中、高鹽濃度下,超聲能量還會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變。