蔡國強(qiáng) (昆山市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 昆山 215300)

前列腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其具有較高的死亡率，大部分患者確診時已處于前列腺癌中期或晚期〔1〕。臨床常采用手術(shù)聯(lián)合放療或化療等綜合技術(shù)治療前列腺癌，但化療藥物具有一定毒副作用〔2,3〕。研究表明烏頭堿可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖從而抑制腫瘤惡性進(jìn)展，同時研究顯示烏頭堿還具有抗炎作用〔4,5〕。但烏頭堿對前列腺癌的影響尚未見報道。研究表明Janus激酶(JAK)2/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號通路激活可抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖從而使前列腺癌惡性進(jìn)展〔6〕。因此，本研究主要探討烏頭堿對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，初步分析其是否可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路而發(fā)揮作用，為臨床合理應(yīng)用烏頭堿提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 烏頭堿購自北納創(chuàng)聯(lián)研究院(純度高于98%)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解烏頭堿，使用前采用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋烏頭堿至實(shí)驗(yàn)所需濃度。前列腺癌細(xì)胞DU145購自美國ATCC公司；胎牛血清與DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)與二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海潤成生物科技有限公司；p-JAK2、p-STAT3抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體均購自上海哈靈生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)處理及分組 DU145細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)(含有10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，每2 d更換1次培養(yǎng)液。收集對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，用不同濃度的烏頭堿處理DU145細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為Control組(未經(jīng)任何處理的DU145細(xì)胞)、烏頭堿5 μg/ml組(用終濃度為5 μg/ml烏頭堿處理DU145細(xì)胞)、烏頭堿10 μg/ml組(用終濃度為10 μg/ml烏頭堿處理DU145細(xì)胞)、烏頭堿20 μg/ml組(用終濃度為20 μg/ml的烏頭堿處理DU145細(xì)胞)〔7〕。每組細(xì)胞各處理48 h。

1.2.2MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 收集各組DU145細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度(5×104個/ml)，接種于96孔板(100 μl/孔)，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上振蕩10 min，應(yīng)用Bio-Tek808酶標(biāo)儀檢測每孔的OD值(490 nm)，根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率(%)=〔(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值)/(正常培養(yǎng)組OD值-空白對照OD值)〕×100%

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基以1∶8的稀釋比稀釋基質(zhì)膠，取100 μl稀釋液包被Transwell小室底部的上室面，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度(1×106個/ml)，Transwell小室上室內(nèi)種植細(xì)胞懸液(200 μl)，Transwell小室下室種植含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(600 μl)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，擦拭未侵襲細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，0.2%結(jié)晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集各組前列腺癌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，每組取1×105個細(xì)胞，4℃條件下1 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，棄上清，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，每次10 min，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，加入5 μl PI，室溫孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，充分混勻，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western印跡檢測Bax、Bcl-2、JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白 前列腺癌DU145細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電泳反應(yīng)條件依次為80 V 30 min，120 V 90 min，根據(jù)標(biāo)記位置切膠，將分離的蛋白凝膠于4℃濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，孵育一抗(4℃孵育過夜)，TBST洗膜3次，每次10 min，室溫條件下孵育二抗(1 h)，TBST洗膜，顯色，曝光顯影，應(yīng)用凝膠分析系統(tǒng)及Quantity One軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1烏頭堿對前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的影響 與Control組DU145細(xì)胞存活率〔(100.00±9.25)%〕相比，烏頭堿5 μg/ml組〔(91.52±9.68)%〕未見顯著變化(P>0.05)；而烏頭堿10 μg/ml組〔(60.37±5.43)%〕和烏頭堿20 μg/ml組〔(48.29±4.37)%〕均顯著下降(均P<0.05)。由于烏頭堿濃度為20 μg/ml時前列腺癌細(xì)胞存活率接近50%，因而選取20 μg/ml的烏頭堿進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2烏頭堿對DU145細(xì)胞侵襲的影響 Control組細(xì)胞侵襲數(shù)目〔(118.24±10.38)個〕顯著高于烏頭堿20 μg/ml組〔(43.35±5.61)個，t=13.702，P=0.000〕。

2.3烏頭堿對DU145細(xì)胞凋亡的影響 Control組細(xì)胞凋亡率〔(3.39±0.27)%〕顯著低于烏頭堿20 μg/ml組〔(39.18±3.65)%，t=29.336,P=0.000〕。見圖1。

圖1 烏頭堿對DU145細(xì)胞凋亡的影響

2.4烏頭堿對DU145細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較，烏頭堿20 μg/ml組Bax水平顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，見表1、圖2。

2.5烏頭堿對DU145細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較，烏頭堿20 μg/ml組p-JAK2、p-STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而JAK2、STAT3蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖3。

表1 烏頭堿對DU145細(xì)胞凋亡及JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 Western印跡檢測烏頭堿對DU145細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western印跡檢測烏頭堿對DU145細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

前列腺癌患者接受手術(shù)治療后，由于術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者預(yù)后不良，因而在圍術(shù)期采取干預(yù)措施有助于改善患者預(yù)后不良，研究表明黃芩素可通過抑制Ezrin蛋白表達(dá)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖及侵襲〔8〕。程翔宇等〔9〕研究表明氯化兩面針堿可通過抑制AKT/mTOR磷酸化而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究報道麻醉藥物及麻醉技術(shù)可影響腫瘤細(xì)胞增殖〔10,11〕。

烏頭堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，但烏頭堿具有一定毒性從而限制其應(yīng)用，研究表明適量的烏頭堿可減輕腫瘤患者疼痛，還可抑制消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔12,13〕。研究報道指出烏頭堿可通過抑制核因子(NF)-κB信號通路激活而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡，還可抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖〔14〕。烏頭堿對胰腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，而對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，抑制腫瘤惡性進(jìn)展〔15〕。本研究結(jié)果提示烏頭堿可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明Bax、Bcl-2蛋白可調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，Bcl-2蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，Bax是細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子〔16〕。本研究結(jié)果提示烏頭堿可通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞異常增殖。

JAK2/STAT3信號通路可參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程，研究表明JAK2/STAT3信號通路激活可促進(jìn)肝癌發(fā)生及發(fā)展，并可作為評估肝癌惡性程度及患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)〔17～19〕。STAT家族屬于重要轉(zhuǎn)錄因子，STAT3與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，STAT3異?；罨纱龠M(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展，抑制STAT3表達(dá)可減弱腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，研究表明抑制JAK2與STAT3的磷酸化可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲〔20〕。本研究結(jié)果提示烏頭堿可通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活而抑制癌基因表達(dá)進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲。

綜上，烏頭堿可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并降低其侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路激活有關(guān)。