王朔 李衛(wèi) 白冰 黃群 薛潤國 邢恩鴻 郭亞春 宋鴻儒

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2承德監(jiān)獄醫(yī)院；3承德市第一中心醫(yī)院；4承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；5河北北方學(xué)院)

急性肝損傷極有可能最終發(fā)展為肝衰竭。急性肝衰竭病勢(shì)急、并發(fā)癥多、難治愈、預(yù)后差。目前針對(duì)急性肝損傷的有效治療方法十分有限，尋找開發(fā)新的治療藥物及治療措施，深入研究和探討急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳(CCl4)制備大鼠急性肝損傷模型。CCl4 有肝臟毒性且導(dǎo)致急性肝損傷的機(jī)制復(fù)雜，研究表明與氧化應(yīng)激有關(guān)〔1〕。氧化應(yīng)激是由于機(jī)體受到活性氧(ROS)等其他有害刺激后體內(nèi)活性氧自由基異常，引起機(jī)體過氧化損傷，進(jìn)而激活了抗氧化損傷防御機(jī)制，來維系機(jī)體氧化還原的平衡。生理自穩(wěn)狀態(tài)下核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-E2相關(guān)因子(Nrf)2 表達(dá)水平較低；當(dāng)機(jī)體受到氧刺激后，Nrf2活化入核與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合并啟動(dòng)下游由ARE調(diào)控的一系列蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)抗氧化應(yīng)激損傷的作用〔2〕。黃芩苷能抗氧化，在一定程度上能保護(hù)大鼠免受CCl4造成急性肝損傷〔3〕，但其水溶性差，黃芩苷鎂鹽吸收更好,且前期實(shí)驗(yàn)已證明黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的SD大鼠急性肝損傷有保護(hù)作用〔4〕。本研究繼續(xù)采用CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠為研究對(duì)象，通過檢測(cè)Nrf2/ARE信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的變化來探討黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)雄性SD大鼠，150～170 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。先將所有大鼠在SPF級(jí)屏障動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲水，室內(nèi)溫度18～22℃，保持室內(nèi)濕度50%～60%，每日光照12 h。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 -80℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；磁力攪拌器(中國江蘇波西瓦爾公司)；MyCycler Thermal Cycler(美國BIO-RAD公司)；低溫高速離心機(jī)(丹麥Labogene公司)；LightCycler? 96(瑞士Roche公司)；GelDoc凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(中國上海Tanon 公司)。凍存樣本核蛋白提取試劑盒(河北貝博實(shí)驗(yàn)用品有限公司)；CCl4(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；異甘草酸鎂注射液(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；注射用還原型谷胱甘肽(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國Thermo公司)；醌氧化還原酶(NQO)1 antibody(美國CST公司)；LaminB1 antibody、BeyoECL Star(中國碧云天公司)；anti-Nrf2 antibody、anti-Heme Oxygenase 1 antibody(英國Abcam公司)；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser 試劑盒、引物、SYBY Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒(中國大連寶生物公司)；黃芩苷鎂鹽(我校劉翠哲教授課題組提供，其純度為93.1%。)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 雄性SD大鼠50只，體重150～170 g，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、模型組、異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組及黃芩苷鎂鹽組，每組10只?？瞻讓?duì)照組與模型組每天尾靜脈注射等體積的無菌生理鹽水；異甘草酸鎂組每天尾靜脈注射異甘草酸鎂18 mg/kg；還原型谷胱甘肽組每天尾靜脈注射還原型谷胱甘肽150 mg/kg；黃芩苷鎂鹽組按照100 mg/kg尾靜脈注射黃芩苷鎂鹽，每日1次，連續(xù)給藥1 w。末次給藥2 h后，各藥物組按1 ml/kg腹腔注射50%的CCl4溶液，空白對(duì)照組腹腔注射等體積的橄欖油溶液。禁食，自由飲水，24 h后用4%水合氯醛麻醉解剖大鼠，腹主動(dòng)脈取血后迅速摘除肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水清潔后于-80℃保存，用于后續(xù)的Western印跡和實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以檢測(cè)各組Nrf2、NQO1 和血紅素氧合酶(HO)-1的蛋白和mRNA 表達(dá)水平。

1.3.2Western印跡 -80℃冰箱取出肝組織樣本，眼科剪碎于研缽，隨后加入蛋白裂解液冰上研磨，裂解反應(yīng)45 min，收集勻漿液至EP管中，置于4℃離心機(jī)進(jìn)行離心(12 000 r/min離心15 min)，轉(zhuǎn)移上清至另一EP管，再次離心(12 000 r/min，15 min，4℃)，收集上清液并分裝，置于-80℃冰箱保存。隨后加入100 ml提前預(yù)冷的緩沖液在離心沉淀物中，渦旋振蕩15 s冰上靜置10 min，反復(fù)4次(冰上反應(yīng)共40 min)；靜置結(jié)束后離心(16 000 r/min，10 min，4℃)，再將上清液移至另一預(yù)冷的無菌EP管中，最終得到的上清即為核蛋白。嚴(yán)格按照BCA定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后于100℃水浴鍋中變性5 min，配制10%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為30 μg，80 V/30 min，120 V/1.5 h進(jìn)行電泳。按照2 mA/cm2膜，恒流轉(zhuǎn)膜2 h。完成轉(zhuǎn)膜后將聚偏氟乙烯(PVDF)膜在含5% 脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，洗膜，加入稀釋好的一抗溶液(量根據(jù)膜面積以0.1 ml/cm2計(jì)算)，于搖床上室溫孵育1～2 h或4℃過夜。TBST洗膜4次，每次7 min。加二抗，搖床上室溫孵育1～2 h。ECL試劑盒顯影，圖像用Quantity one軟件分析，LaminB進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 常規(guī)提取肝組織中的總RNA,按照試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,Nrf2、HO-1、NQO1及內(nèi)參 GAPDH的引物分別為Nrf2：上游引物：5′-GACCTAAAGCACAGCCAACACAT-3′，下游引物：5′-CTCAATCGGCTTGAATGTTTGTC-3′；HO-1：上游引物：5′-TGTCCCAGGATTTGTCCGAG-3′，下游引物：5′-ACTGGGTTCTGCTTGTTTCGCT-3′；NQO1：上游引物：5′-GGGGACATGAACGTCATTC-TCT-3′,下游引物：5′-AGTGGTGACTCCTCCCAGACAG-3′；GAPDH：上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR，利用 2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，其余各組Nrf2蛋白水平均顯著升高，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組HO-1、NQO1蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)。見圖1、表1。

1～5：空白對(duì)照組，模型組，異苷草酸鎂組，還原型谷胱甘肽組，黃芩苷鎂鹽組圖1 Western印跡檢測(cè)各組Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)

表1 各組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平比較

2.2各組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平比較 與空白對(duì)照組比較，其余各組Nrf2 mRNA水平均顯著升高，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組HO-1、NQO1 mRNA水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，梨頭草提取物、青蒿琥酯、鬼針草水提物、雷公藤總苷、青藤堿等能通過緩解氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷起到保護(hù)作用〔5～8〕。機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激后，體內(nèi)多種信號(hào)通路被激活，通過多種途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。Nrf2/ARE信號(hào)通路可以通過調(diào)控Ⅱ相解毒酶及抗氧化物基因的表達(dá)來調(diào)控肝臟新陳代謝促進(jìn)毒物外排起到抗氧化作用，同時(shí)還可以促進(jìn)肝細(xì)胞再生，從而保護(hù)肝臟〔9～11〕。

在肝、腎等解毒器官中高表達(dá)的Nrf2是調(diào)控抗氧化重要轉(zhuǎn)錄因子〔12〕。胞質(zhì)內(nèi)Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1是Nrf2的特異性受體。生理自穩(wěn)狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中與Keap1耦聯(lián)，其活性被抑制，同時(shí)通過Keap1 介導(dǎo)的泛素化對(duì)Nrf2進(jìn)行持續(xù)降解以維持與轉(zhuǎn)錄形成的Nrf2之間的平衡〔13〕。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激后，Keap1介導(dǎo)的泛素化被阻止，同時(shí)Keap1 的構(gòu)像發(fā)生改變，使Nrf2 與Keapl 發(fā)生解耦聯(lián),Nrf2 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并與下游的目的基因ARE 結(jié)合，從而啟動(dòng)下游多個(gè)抗炎、抗氧化蛋白及解毒酶等基因的表達(dá)，進(jìn)而激活Nrf2 信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化作用，促進(jìn)機(jī)體毒物的外排〔14〕。有研究表明敲除Nrf2基因的小鼠，肝臟中丙二醛(MDA)水平會(huì)顯著升高，小鼠會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝損傷。相反激活Nrf2及其下游基因HO-1表達(dá)，可降低體內(nèi)MDA和ROS水平，減輕過氧化反應(yīng)所引起的肝損傷〔15〕。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用黃芩治療濕熱黃疸等肝膽病，黃芩苷鎂鹽是其有效成分黃芩苷在藥材中的存在形式，研究證明黃芩苷能抗氧化，對(duì)CCl4致大鼠肝損傷有保護(hù)作用〔3〕，且黃芩苷鎂鹽水溶性好，比黃芩苷更容易被吸收。本研究結(jié)果表明黃芩苷鎂鹽能夠顯著促進(jìn)Nrf2蛋白的活化及核內(nèi)基因的表達(dá)，Nrf2活化后入核與ARE結(jié)合，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，啟動(dòng)下游HO-1和NQO1基因表達(dá)，促進(jìn)HO-1和NQO1蛋白合成。本研究結(jié)果說明黃芩苷鎂鹽在CCl4誘導(dǎo)大鼠的急性肝損傷模型體內(nèi)，能夠調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路。還原型谷胱甘肽具有較強(qiáng)清除自由基、抑制胞膜脂質(zhì)過氧化作用，本研究結(jié)果說明GSH能夠通過調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡，對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷保護(hù)作用機(jī)制可能與Nrf2/ARE信號(hào)通路被激活有關(guān)，通過上調(diào)下游HO-1和NQO1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用，降低肝組織中MDA水平，促進(jìn)機(jī)體毒物外排，從而減輕CCl4對(duì)肝臟的損傷程度。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予CCl4造模也可提高Nrf2的核內(nèi)表達(dá)，這可能是由于外界刺激，肝細(xì)胞防御性應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的。但急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，多種機(jī)制參與，黃芩苷鎂鹽對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用，可能還會(huì)通過其他的途徑進(jìn)行調(diào)控，有待日后進(jìn)一步研究。