張芳瓊 王嘉怡 楊萍

(1湖北省秭歸縣人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，湖北 宜昌 443600；2湘南學(xué)院醫(yī)學(xué)影像與檢驗學(xué)院；3江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)心血管內(nèi)科)

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體引起的炎性疾病，兒童發(fā)病率最高，肺炎支原體可影響機體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)多種炎癥因子釋放，影響機體免疫功能〔1〕。肺炎支原體肺炎發(fā)病機制復(fù)雜，受到miRNA、信號通路等的影響〔2〕。miR-222-3p是一個多功能影響因子，與炎癥等進(jìn)展有關(guān)〔3〕。miR-222-3p在肺炎支原體肺炎患者中高表達(dá)，且miR-222-3p可能通過下調(diào)CD4+水平影響機體免疫反應(yīng)〔4〕。本實驗旨在探討miR-222-3p在肺炎支原體肺炎小鼠免疫機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級BALB/c小鼠，4～6 w，體重18～22 g，由三峽大學(xué)提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2017-0012。藥品與試劑：miRcute增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(購于天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)，貨號：KR211)、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)，貨號：FP411)；miR-222-3p agomir陰性對照、miR-222-3p agomir、miR-222-3p antagomir陰性對照、miR-222-3p antagomir由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建提供；肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株購自上海佰泰科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-1β測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，貨號：SEKR-0002；IL-6測定試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司，貨號：ZC-37988；干擾素(IFN)-γ測定試劑盒購于上海恪敏生物科技有限公司，貨號E-EL-R0578；IL-10測定試劑盒購于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，貨號：F11829-1；免疫球蛋白(Ig)G測定試劑盒由上海將來實業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；IgM測定試劑盒由北京貝爾生物工程有限公司生產(chǎn)；大鼠抗CD4-FITC抗體購于上海江萊生物科技有限公司，貨號：ANT-292；大鼠抗CD8-PE抗體購于艾美捷科技有限公司，貨號：8120-09。儀器：PT-350C酶標(biāo)儀，北京普天新橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；Qi3536血細(xì)胞計數(shù)器，長沙巴躍儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2模型建立〔5〕小鼠飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度在50%左右，不限制飲水。各組小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，用水合氯醛麻醉，滴鼻接種肺炎支原體菌液100 μl(1×107CCU/ml)，連續(xù)滴鼻接種3 d，接種后保持小鼠頭部向后傾斜45°約1 min。觀察小鼠精神狀態(tài)欠佳，飲食量下降，鼻腔分泌物增多，撓鼻，則初步判定造模成功。

1.3動物分組與給藥方法 60只造模成功的小鼠隨機分成模型組、miR-NC組、miR-222-3p組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-222-3p組，每組12只，另外隨機選取12只小鼠作為對照組，小鼠滴鼻等量生理鹽水。miR-NC組、miR-222-3p組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-222-3p組造模后第2天，分別尾靜脈注射20 μg(溶解于2.5 ml生理鹽水)〔6〕miR-222-3p agomir陰性對照、miR-222-3p agomir、miR-222-3p antagomir陰性對照、miR-222-3p antagomir，對照組和模型組給予等劑量生理鹽水尾靜脈注射。連續(xù)注射5 d。最后1次注射后次日，摘取眼球，采集血液，一部分血液分離血清組織，用于血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM檢測，一部分抗凝處理，用于檢測T淋巴細(xì)胞亞群。水合氯醛麻醉小鼠，切開胸部皮膚，分離氣管，結(jié)扎右肺，插入一次性輸液管，注入生理鹽水2.5 ml，灌洗肺泡，收集肺泡灌洗液，用于炎性細(xì)胞計數(shù)。取左肺，用于肺組織病理學(xué)評分和miR-222-3p表達(dá)檢測。

1.4Realtime PCR方法檢測miR-222-3p表達(dá)〔7〕取肺組織，用Trizol試劑提取總RNA，以miRcute增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行Realtime PCR，內(nèi)參為U6。引物為U6上游(5＇-3＇)-CAGCACATACTAAAATTGGAACG，下游(5＇-3＇)-ACGAA-TTTGCGTGTCATCC，上游(5＇-3＇)-GAAAGTTCGTCCAGCTACATCTG，miR-222-3p下游(5＇-3＇)-TATGGTTGTTCTCGTCTCTGTGTC。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM〔8〕收集血清，根據(jù)IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM測定試劑盒檢測血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IgG、IgM含量，步驟同試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群〔9〕收集100 μl抗凝血，離心后吸取上清，添加10 μl CD4-FITC、CD8-PE抗體，混合后，在室溫避光條件下結(jié)合30 min，添加500 μl紅細(xì)胞裂解液，混勻后，室溫孵育30 min。3 000 r/min離心5 min。棄掉上清，繼續(xù)加入500 μl緩沖液，室溫結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)炎性細(xì)胞〔10〕肺泡灌洗液以300 r/min離心10 min，取沉淀，用生理鹽水懸浮并定容到200 μl。血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)炎性細(xì)胞總數(shù)。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色評價肺組織病理學(xué)變化〔5〕肺組織放在4%多聚甲醛中固定，蒸餾水洗滌，以不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟切片，放在60℃烘箱中孵育30 min。用二甲苯及濃度梯度乙醇將肺組織中的石蠟脫去。切片放在蘇木素中染色10 min，蒸餾水洗滌，伊紅染色5 min。二甲苯透明，中性膠封片。在顯微鏡下對肺組織病理學(xué)進(jìn)行評分，評分從細(xì)支氣管/支氣管浸潤、定性、管腔滲出、血管周圍浸潤、實質(zhì)性肺炎5個方面進(jìn)行評價，評價標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔11〕。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-222-3p表達(dá)比較 對照組、模型組、miR-NC組、miR-222-3p組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-222-3p組肺組織中miR-222-3p表達(dá)量分別為1.00±0.12、1.53±0.25、1.61±0.11、3.21±0.34、1.63±0.12、0.85±0.08，模型組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-222-3p組與miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Anti-miR-222-3p組與Anti-miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組血清中炎癥因子比較 模型組血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10含量與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-222-3p組與miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Anti-miR-222-3p組與Anti-miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10含量比較

2.3各組血清中IgG、IgM比較 對照組、模型組、miR-NC組、miR-222-3p組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-222-3p組血清中IgG含量為(1.77±0.17)mg/ml、(2.90±0.27)mg/ml、(2.91±0.26)mg/ml、(3.25±0.21)mg/ml、(2.86±0.29)mg/ml、(2.38±0.40)mg/ml，IgM含量為(0.53±0.06)mg/ml、(0.96±0.08)mg/ml、(0.92±0.15)mg/ml、(1.29±0.13)mg/ml、(0.94±0.10)mg/ml、(0.73±0.05)mg/ml，模型組血清中IgG、IgM含量與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-222-3p組與miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Anti-miR-222-3p組與Anti-miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+水平比較 對照組、模型組、miR-NC組、miR-222-3p組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-222-3p組T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+水平為3.86±0.16、1.63±0.15、1.64±0.12、1.37±0.08、1.59±0.14、2.55±0.33，模型組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-222-3p組與miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Anti-miR-222-3p組與Anti-miR-NC組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5各組肺組織病理學(xué)評分和肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目比較 模型組肺組織病理學(xué)評分和肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-222-3p組與miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Anti-miR-222-3p組與Anti-miR-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織病理學(xué)評分和肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目比較

3 討 論

肺炎支原體感染可影響機體免疫功能。輔助型T細(xì)胞亞型Th1/Th2比值失衡是誘導(dǎo)炎癥損傷發(fā)生的關(guān)鍵因子，Th1/Th2比值失衡促進(jìn)IFN-γ釋放，而IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，抑制IL-10等免疫抑制因子表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6表達(dá)，加強炎癥反應(yīng)〔2,11〕。T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+可間接反映機體免疫功能，因此檢測CD4+/CD8+比值可反映機體免疫水平〔12〕。IgG、IgM屬于免疫球蛋白，其水平高低與機體免疫功能有關(guān)〔13〕。本實驗顯示，肺炎支原體感染后的小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ含量升高，IgG、IgM含量升高，且IL-10含量降低，且CD4+/CD8+比值降低，肺組織病理學(xué)評分和肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目增加，說明成功構(gòu)建了肺炎支原體肺炎小鼠模型。

肺炎支原體肺炎分子發(fā)生機制復(fù)雜，與miRNA等表達(dá)有關(guān)〔3〕。miR-222-3p是與腫瘤〔14〕、免疫炎癥反應(yīng)〔3〕等有關(guān)的調(diào)控因子。報道顯示〔4,15〕，miR-222-3p在肺炎支原體肺炎中高表達(dá)，且下調(diào)miR-222-3p可抑制肺炎支原體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥，miR-222-3p可能是肺炎支原體肺炎的促進(jìn)因子。本實驗表明，過表達(dá)miR-222-3p可進(jìn)一步提高血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM含量，降低IL-10含量，降低CD4+/CD8+比值，提高肺組織病理學(xué)評分和肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目，而抑制miR-222-3p發(fā)揮相反的作用，說明miR-222-3p在肺炎支原體感染小鼠免疫機制中發(fā)揮促進(jìn)作用，為進(jìn)一步研究肺炎支原體肺炎分子發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)。