林莉香 云紅葉 黃守國 (中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院婦產(chǎn)科，海南 海口 570208)

卵巢癌是最致命的女性婦科腫瘤之一，因卵巢癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，導致死亡率較高〔1〕。目前臨床上治療卵巢癌的手段主要為外科手術和全身化療，但仍具有較高的復發(fā)率〔2〕。二甲雙胍是治療糖尿病的一種有效藥物，越來越多的研究已經(jīng)證實二甲雙胍在治療婦科相關腫瘤中同樣具有顯著的療效〔3～5〕，例如研究〔6〕發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過介導信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3信號通路抑制卵巢癌細胞的惡性生物學行為，進而發(fā)揮抗癌作用，然而二甲雙胍在卵巢癌中的作用機制尚未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)己糖激酶(HK)2在卵巢癌組織中高表達，且高表達的HK2可顯著促進卵巢癌細胞增殖〔7〕，本研究旨在探討二甲雙胍對卵巢癌細胞增殖、遷移及糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 SKOV3細胞購自碧云天生物技術有限公司。二甲雙胍粉末(純度：≥98%，貨號：D9351)購自北京索萊寶有限公司；Lipofectamine 2000、DMEM、青霉素、鏈霉素購自北京杰輝博高生物技術有限公司；CCK-8試劑購自愛必信(上海)生物科技有限公司；HK2抗體(HK8797)購自上海戶實科技有限公司；E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)抗體(ab40772)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)抗體(ab216347)、β-actin抗體(ab115777)購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(AS003)購自蘇州遠東普惠生物技術有限公司；葡萄糖攝取比色檢測試劑盒(MAK083-1KT)、乳酸比色測定試劑盒(MAK058-1KT)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；ATP比色試劑盒(BJ-S6336)購自上海邦景實業(yè)有限公司；pcDNA-NC和pcDNA-HK2由上海吉瑪生物技術有限公司提供。

1.2細胞培養(yǎng)〔8〕參考文獻〔4〕的方法復蘇細胞，觀察細胞，當細胞密度達到90%時進行傳代：用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次后去除血清，用500 μl的胰酶(含DMEM)進行消化，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱靜置4 min后加入1 ml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，離心后(1 000 r/min，5 min)棄上清，加入1 ml DMEM重懸細胞，于條件為37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3細胞轉(zhuǎn)染與分組〔9〕當細胞融合度≥80%時，收集細胞，用不同濃度的二甲雙胍(0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L)處理細胞，記為0、5、10、20 mmol/L Met組，進行增殖遷移等系列實驗，選用作用效果最好的二甲雙胍劑量組進行后續(xù)研究。二甲雙胍的配制參考文獻〔4〕，并將細胞分為Met+pcDNA-NC組(最佳劑量二甲雙胍+轉(zhuǎn)染pcDNA-NC)，Met+pcDNA-HK2組(最佳劑量二甲雙胍+轉(zhuǎn)染pcDNA-HK2)，待細胞融合度≥80%時，根據(jù)Lipofectamine2000操作說明分別把pcDNA-NC和pcDNA-HK2轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞，培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4CCK-8實驗檢測SKOV3細胞增殖〔10〕收集各組細胞，將細胞接種于96孔板上，密度為6 000個/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，之后用酶標儀于450 nm處測定吸光值，之后的每天同一時間點加入CCK-8試劑，培養(yǎng)2～3 h后檢測吸光值，共檢測4 d。

1.5SKOV3細胞葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP含量的測定〔11〕參考文獻〔4〕的方法，將細胞接種于96孔板中，用100 ml KRPH緩沖液(含2%牛血清白蛋白)孵育細胞40 min 后加入10 ml L2-DG，20 min后根據(jù)葡萄糖攝取試劑盒說明進行測定。乳酸和ATP含量的測定嚴格按照乳酸測定試劑盒和ATP比色試劑盒操作說明書進行操作。

1.6Transwell檢測SKOV3細胞遷移能力〔12〕收集各組細胞，用無血清培養(yǎng)基處理細胞，Transwell小室膜水化預處理后，上室加入100 μl的細胞懸液，下室加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，進行固定和染色，隨機選取視野顯微鏡下進行觀察，并記錄。

1.7Western印跡檢測SKOV3細胞中HK-2、E-cadherin和Snail蛋白的表達〔13〕收集各組細胞，用PBS洗滌，加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，裂解30 min后離心，收集上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白，進行定量，根據(jù)定量的結果進行電泳并轉(zhuǎn)膜，并用5%的脫脂牛奶進行封閉1 h，然后加入HK2(1∶500)、E-cadherin(1∶10 000)、Snail(1∶1 000)、β-actin(1∶200)一抗，4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，共孵育1 h后，加入電化學(ECL)發(fā)光液進行曝光。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1二甲雙胍對卵巢癌細胞增殖的影響 不同濃度的二甲雙胍處理卵巢癌SKOV3細胞72 h后，卵巢癌細胞的增殖均受到顯著抑制(P<0.05)，其中20 mmol/L二甲雙胍組對細胞增殖的抑制效果最明顯。見表1。

表1 各組不同時間點OD值比較

2.2二甲雙胍對卵巢癌細胞遷移的影響 與0 mmol/L Met組相比，其他組SKOV3細胞遷移數(shù)目、Snail蛋白表達量顯著減少(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)，見圖1，表2。

1～4:0 mmol/L Met組，5 mmol/L Met組，10 mmol/L Met組，20 mmol/L Met組；圖2同圖1 二甲雙胍對卵巢癌細胞E-cadherin和Snail蛋白表達的影響

表2 各組遷移數(shù)目、E-cadherin、Snail蛋白表達水平、葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生、ATP濃度比較

2.3二甲雙胍對卵巢癌糖酵解的影響 由表2可見，不同濃度的二甲雙胍處理細胞后，與0 mmol/L Met組相比，其他組葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生及ATP濃度均顯著下降(P<0.05)，但5 mmol/L Met組的葡萄糖攝取除外(P>0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)。

2.4二甲雙胍對HK2表達的影響 與0 mmol/L Met組HK2蛋白水平(0.94±0.09)相比，5、10、20 mmol/L Met組〔(0.72±0.07)、(0.62±0.08)、(0.41±0.06)〕均顯著降低(P<0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)，見圖2。

圖2 二甲雙胍對卵巢癌細胞HK2蛋白表達的影響

2.5二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌細胞增殖 與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcD-NA-HK2組48 h后細胞增殖和HK2蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，見圖3、表3。

1，2：Met+pcDNA-NC組，Met+pcDNA-HK2組；下圖同圖3 各組卵巢癌細胞HK2蛋白表達的比較

表3 各組細胞HK2蛋白表達水平以及OD值的比較

2.6二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌糖酵解途徑與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcDNA-HK2組葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生及ATP濃度顯著增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生和ATP濃度、遷移數(shù)目、E-cadherin、Snail蛋白水平的比較

2.7二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌細胞遷移 與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcDNA-HK2組的細胞遷移數(shù)目和Snail蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達量顯著減少(P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細胞E-cadherin和Snail蛋白表達的比較

3 討 論

鉑類化療是臨床上治療卵巢癌的主要手段之一，但化療的失敗是導致卵巢癌復發(fā)的主要原因〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍抗腫瘤有顯著療效，曹妮妮等〔15〕發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著抑制肺癌細胞的增殖和遷移。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制卵巢癌細胞的增殖及遷移能力〔4〕，鄒歌等〔16〕研究已證實二甲雙胍可抑制卵巢癌細胞的遷移。

腫瘤細胞即使在有氧環(huán)境下仍然進行無氧糖酵解，這種現(xiàn)象的發(fā)生可以增加代謝通量向多個生物途徑轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生的能量可促進腫瘤細胞的增殖〔17〕。目前已有研究證實糖酵解途徑參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展〔18〕。本研究結果提示二甲雙胍可通過調(diào)控糖酵解途徑抑制SKOV3細胞的增殖和遷移。在正常情況下，HK2位于細胞質(zhì)和線粒體上，HK2的主要作用就是參與糖酵解，為細胞提供能量。線粒體中產(chǎn)生的ATP會通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)釋放到細胞質(zhì)中，然后構成mPTP的HK2和電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白(VDAC)1的結合會得到附近的能量供應，從而促進糖酵解的發(fā)生〔19〕。本研究結果發(fā)現(xiàn)HK2可扭轉(zhuǎn)二甲雙胍對SKOV3細胞增殖、糖酵解及細胞遷移的抑制。

綜上，二甲雙胍可通過下調(diào)HK2的表達抑制SKOV3細胞糖酵解，進而抑制SKOV3細胞的增殖和遷移。