黃皓章 鄧家強 (南寧市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科二區(qū)，廣西 南寧 530021)

當心臟受損或產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時，心肌成纖維細胞(CFs)激活，細胞增殖使細胞外基質(zhì)膠原蛋白沉積過多，而沉積的膠原蛋白在細胞因子、生長因子和酶相互作用下變硬，更難被對應(yīng)的蛋白酶分解，就導(dǎo)致心肌纖維化〔1,2〕。心肌纖維化使心肌供氧和營養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致心肌生物電效應(yīng)和結(jié)構(gòu)改變，使患者易患心律失常、心力衰竭和缺血性心臟病等〔3〕。目前臨床主要是通過藥物防治或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，但藥物副作用較大，難以達到預(yù)期的效果。因此，迫切需要一種方法治療CFs纖維化。研究報道微小RNA(miRNA)可調(diào)節(jié)不同類型的纖維化疾病〔4〕，其中miR-335有顯著抗肝纖維化作用〔5〕，但是對CFs纖維化相關(guān)研究較少，本研究旨在探討miR-335在血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)CFs纖維化中作用，并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 人CFs(貨號HUM-CELL-0016)購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，DMEM/F12培養(yǎng)基(貨號A4192001)購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS，貨號SH30396.03)購自美國Hyclone公司，RNA提取試劑Trizol(貨號5301005)購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號RR047A)購自日本TaKaRa公司,雙熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號E1910)購自美國Promega 公司,Lipofectamine3000(貨號L3000001)購自美國ThermoFisher公司,熒光素酶報告基因質(zhì)粒由上海和元生物有限公司設(shè)計并構(gòu)建。人Ⅰ型膠原蛋白(COL)-Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附試驗(EILISA)試劑盒(貨號H142)、COL-Ⅲ ELISA試劑盒(貨號H144)均購自南京建成生物工程研究所，人轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒(貨號ml064258)、人結(jié)締組織生長因子(CTGF) ELISA試劑盒(貨號ml025961-2)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，趨化因子(CCL)5抗體(貨號bs-20765R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AngⅡ(貨號P186)購自美國Sigma公司。

1.2儀器 單光子檢測儀(型號SPY-D-II)購自上海中庸檢驗設(shè)備有限公司，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)qRT-(PCR)儀(型號1C480)購自瑞士Roche公司，二氧化碳培養(yǎng)箱(型號GALAXY)購自英國RSBiotech公司，電泳儀(型號1658001)購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 人CFs接種于無菌細胞培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液，并觀察細胞形態(tài)，待細胞長至80%～90%時，消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行以下實驗。

1.3.2采用AngⅡ誘導(dǎo)CFs纖維化模型 CFs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min，重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，以每孔2 ml含AngⅡ終濃度為1×10-6mol/L的DMEM/F12完全培養(yǎng)基接種于六孔板中，每組均設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組加入同體積不含AngⅡ的完全培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3轉(zhuǎn)染分組 24 h后取出1.3.2中細胞，分別用不含血清的培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1-NC質(zhì)粒和pcDNA3.1-miR-335 mimic質(zhì)粒與Lipofectamine3000混合均勻，按照Lipofectamine3000說明書給予AngⅡ處理的細胞轉(zhuǎn)染。實驗分為空白對照組、AngⅡ組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-335 mimic組，每組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后以每孔2 ml更換新鮮完全養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4qRT-PCR檢測miR-335、CCL5 mRNA相對表達 各組轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，提取總RNA，由引物合成軟件Primer Premier 6.0設(shè)計引物序列，miR-335：正義鏈：5′-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3′，反義鏈：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′；CCL5：正義鏈：5′-GACAGCACGTGGACCTCGCA-3′，反義鏈：5′-TTGA-TGTGGGCACGGGGCAG-3′；U6：正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′；β-actin：正義鏈：5′-GCACCGTCMGG-CTGAGMC-3′，反義鏈：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA合成cDNA，并擴增，嚴格按照定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，以U6、β-actin為對照，反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性15 min、90℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個循環(huán)。收集各組Ct值進行數(shù)據(jù)分析，計算目的基因相對于內(nèi)參基因的表達量用2-ΔΔCt表示。

1.3.5采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測觀察CFs的增殖 取出1.3.3中細胞轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，每孔加入20 μl 濃度0.5% MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，待結(jié)晶溶解后在酶標儀波長570 nm處測吸光度值(OD值)。細胞增殖率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.6雙熒光素酶報告基因檢測 根據(jù)CCL5基因序列信息,使用 TargetScan 軟件預(yù)測CCL5基因3′UTR與miR-335可能存在的結(jié)合位點，構(gòu)建含有CCL5的野生型和突變型3′UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒(CCL5-Wt和CCL5-Mut)與miR-335 mimic、NC共染至CFs，48 h后收集細胞。按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，使用單光子檢測儀檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，每組實驗設(shè)6個復(fù)孔。

1.3.7ELISA檢測COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF 取出COL-Ⅰ試劑盒，室溫復(fù)溫30 min，1.3.3中CFs轉(zhuǎn)染24 h后，分別收集各組細胞上清液，嚴格按照ELISA說明書操作，測定450 nm波長下OD值，根據(jù)標準品的濃度和OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)所測樣本的平均OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)算出樣本中各組CFs中COL-Ⅰ含量。同樣方法測定各組細胞中COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF的含量。

1.3.8Western印跡檢測各組細胞中CCL5 相對表達量 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，每組細胞PBS清洗，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白的濃度，按照4∶1在蛋白中加5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量20 μg，上樣后進行蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，轉(zhuǎn)膜，加入抗體CCL5(1∶500稀釋)、β-actin(1∶1 000)孵育，放置4℃過夜，TBST清洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h，TBST清洗后，參考電化學(ECL)發(fā)光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。Image J對條帶灰度值分析。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1過表達miR-335對CFs細胞中miR-335、CCL5 mRNA表達水平的影響 與空白對照組相比，AngⅡ組、AngⅡ+NC組CFs細胞中miR-335相對表達水平顯著降低，CCL5 mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)；AngⅡ+miR-335 mimic組細胞中miR-335、CCL5 mRNA相對表達水平無顯著差別(P>0.05)。與AngⅡ組、AngⅡ+NC組相比，AngⅡ+miR-335 mimic組細胞中miR-335相對表達水平顯著升高，CCL5 mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞中miR-335和CCL5 mRNA相對表達水平

2.2miR-335-5過表達對細胞中CCL5蛋白相對表達水平的影響 與空白對照組CCL5蛋白表達水平(0.43±0.10)相比，AngⅡ組、AngⅡ+NC組〔(0.95±0.12)、(0.89±0.11)〕顯著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335 mimic組(0.42±0.09)無顯著變化(P>0.05)。與AngⅡ組、AngⅡ+NC組相比，AngⅡ+miR-335 mimic組細胞中CCL5蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1。

1～4:空白對照組、Ang Ⅱ組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-335 mimic組圖1 各組細胞中CCL5蛋白相對表達水平

2.3miR-335過表達對各組CFs細胞增殖能力影響 與空白對照組比較，同一時間AngⅡ組、AngⅡ+NC組中CFs細胞增殖率顯著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335 mimic組無顯著差異(P>0.05)；與AngⅡ組、AngⅡ+NC組相比，AngⅡ+miR-335 mimic組AngⅡ誘導(dǎo)CFs細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 miR-335過表達對AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細胞增殖率比較

2.3miR-335-5過表達對CFs細胞COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量影響 與空白對照組相比，AgⅡ組、AngⅡ+NC組細胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量顯著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335mimic組細胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與AgⅡ組、AngⅡ+NC組相比，AngⅡ+miR-335mimic細胞中COL-Ⅰ,COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 CFs細胞COL-Ⅰ,COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF相對表達量

圖2 TargetScan 軟件預(yù)測CCL5基因靶向

2.4miR-335與CCL5存在靶向作用 TargetScan 軟件預(yù)測CCL5 3′UTR與miR-335存在結(jié)合位點。見圖2。與miR-335 NC+WT-CCL5 3′UTR組熒光素酶相對活性(2.47±0.31)比較，miR-335 mimic+CCL5 3′UTR組(1.69±0.29)顯著降低(P<0.05)；miR-335 NC+MUT-CCL5 3′UTR組(2.44±0.35)、miR-335 mimic+MUT-CCL5 3′UTR組(2.40±0.27)熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

心肌纖維化主要是CFs過度增殖和膠原蛋白表達、分泌過多引起的，通常伴隨著心肌肥厚、心肌梗死等病理學變化，是冠心病、高血壓性心臟病等多種心血管疾病發(fā)生的共同基礎(chǔ)〔6〕。心肌纖維化涉及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ等編碼細胞外基質(zhì)蛋白和TGF-β、CTG等細胞因子調(diào)節(jié)參與〔7〕。研究表明AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要成分，可促進CFs細胞增殖、膠原蛋白堆積誘導(dǎo)CFs纖維化，因此廣泛使用AngⅡ為刺激因子建立心肌纖維化模型〔8〕。本研究結(jié)果提示AngⅡ誘導(dǎo)CFs細胞纖維化模型成功。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)小分子非編碼RNA，通過與靶mRNA的堿基配對，調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、生理和病理生理過程等生物學功能，并在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用〔9〕。研究表明miRNA參與調(diào)節(jié)CFs纖維化，如miR-133在心肌細胞和CFs中均有表達，研究發(fā)現(xiàn)miR-133低表達可引起心肌膠原蛋白和細胞外基質(zhì)表達及分泌增加，與心肌纖維化有關(guān)〔10〕。已有報道在肝纖維化的發(fā)病機制中，miR-335有抗纖維化作用〔11〕。miR-335在肝星狀細胞活化和肝纖維化過程中顯著降低，恢復(fù)miR-335的表達可抑制肝星狀細胞的遷移和降低COL-Ⅰ表達〔12〕。本研究結(jié)果提示miR-335表達降低可能與心肌CFs纖維化有關(guān)；miR-335過表達模型建立成功。心肌纖維化與CFs大量增殖有關(guān)〔13〕，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-335抑制肺成纖維細胞的增殖〔14〕，此外敲除miR-335-3p可促進人牙齦成纖維細胞的成纖維活性〔15〕。本研究結(jié)果提示AngⅡ促進心肌CFs增殖，miR-335過表達抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌CFs的增殖。

細胞外基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白，包括COL-Ⅰ、COL-Ⅲ，過量膠原蛋白堆積于組織間隙，膠原纖維降解失衡，導(dǎo)致心肌纖維化〔16〕。心肌纖維化形成和發(fā)展同時伴隨多種細胞因子的參與，主要是CTGF和TGF-β，其中CTGF可直接誘導(dǎo)膠原生成，促進纖維化發(fā)生，TGF-β可促進細胞增殖和細胞外基質(zhì)聚集，同時也誘導(dǎo)CTGF生成〔17,18〕。本研究結(jié)果提示miR-335過表達可能通過下調(diào)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF水平改善心肌CFs纖維化。研究表明CCL5在肝纖維化中起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，首先肝細胞中過多CCL5可刺激肝星狀細胞增殖、遷移，增加膠原生成；其次CCL5可與受體CCR5結(jié)合誘導(dǎo)正常肝細胞脂肪變性，產(chǎn)生促炎性因子，促進肝纖維化〔19〕。此外，研究發(fā)現(xiàn)CCR2和CCR5及其配體CCL2和CCL5之間的相互作用通過促進單核/巨噬細胞的募集和組織浸潤，介導(dǎo)纖維化的發(fā)生〔20〕。本研究結(jié)果提示CFs纖維化可能與上調(diào)CCL5表達有關(guān)；雙熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-335能夠靶向CCL5；miR-335過表達可下調(diào)CCL5相對表達。

綜上，miR-335可能通過靶向調(diào)控CCL5，降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF水平，改善AngⅡ誘導(dǎo)的CFs纖維化，提示CCL5可能作為抗心肌纖維化的靶點。