鄭霞 譚文婷 易嘉莉 李亞靈 劉達(dá) 王森 宋熊 張晶晶 褚春 楊軍

(南華大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421000；2附屬第二醫(yī)院藥劑科)

代謝綜合征(MS)是指機(jī)體的碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生代謝異常并集中出現(xiàn)的一種臨床癥候群，是多種心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素〔1〕。MS人群的心血管疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)〔2〕，而且其可導(dǎo)致負(fù)性心室重構(gòu)，最終引起心力衰竭。MS可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)〔3，4〕，但其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制仍不是十分清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/Smad2通路不但參與了MS的發(fā)病過(guò)程，而且與心肌纖維化的發(fā)生及發(fā)展密切關(guān)聯(lián)〔5〕。硫化氫(H2S)是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，已被證實(shí)在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，研究顯示其具有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抗凋亡、抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)效應(yīng)〔6〕。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，H2S可以通過(guò)不同的機(jī)制減輕多種不同心血管疾病大鼠的心肌纖維化，而H2S是否可以減輕MS大鼠的心肌纖維化及具體作用機(jī)制目前尚不明確，因此本研究以高糖高脂飲食誘使大鼠發(fā)生心肌纖維化，同時(shí)予以H2S干預(yù)，觀察H2S對(duì)MS大鼠心肌纖維化的影響及內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重(150±20)g的40只健康成年雄性SD大鼠，由長(zhǎng)沙斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在溫度(24±3)℃、通風(fēng)度和濕度適宜的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單籠喂養(yǎng)，采用人工照明，設(shè)定光照周期為12 h。大鼠均自由攝食和飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 硫氫化鈉 (NaHS)購(gòu)于Sigma公司；彩色預(yù)染Marker購(gòu)于Fermentas公司；TGF-β1、Smad2、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗大鼠一抗及抗兔二抗均購(gòu)自Proteintech公司。

1.3分組及模型的建立 40只雄性SD大鼠放于適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后分成：正常組、MS組、MS+H2S組、H2S組，每組10只大鼠，MS組及MS+H2S組采取高糖高脂飲食的方式造?！?〕，其余兩組喂養(yǎng)同等量的普通飼料。按查閱文獻(xiàn)中的指標(biāo)確定建模成功后〔8〕，MS+H2S組和H2S組予以NaHS〔56 μmol/(kg·d)，用生理鹽水稀釋〕腹內(nèi)注射6 w，另兩組則以同等量的生理鹽水腹內(nèi)注射，6 w后，稱量所有大鼠的體重后將其麻醉處死，留取心臟標(biāo)本，用于后期檢驗(yàn)。

1.4血清生化指標(biāo)及尾動(dòng)脈血壓檢測(cè) 各組大鼠予以不同的飼料喂養(yǎng)6 w后，以測(cè)量3次有效的尾動(dòng)脈收縮壓平均值為大鼠的血壓；禁食后抽取空腹血，以血糖檢測(cè)儀(試紙法)測(cè)取空腹血糖；采1.5～2.0 ml的尾靜脈血，三酰甘油以甘油磷酸氧化酶法測(cè)定，膽固醇以酶比色法測(cè)取。

1.5Masson染色分析纖維化程度 取甲醛固定的大鼠心肌組織，以石蠟包埋，制作厚約4 μm的切片，常規(guī)脫蠟至水，以不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理后，以Masson試劑盒染色，并以梯度酒精脫水，最后樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6Western印跡觀察心肌組織中TGF-β1、Smad2蛋白的表達(dá) 取各組大鼠的部分心肌組織，充分研磨后提取組織蛋白，然后對(duì)照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說(shuō)明書有步驟的完成蛋白定量，并嚴(yán)格遵照Western印跡的具體步驟，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，并以TGF-β1、Smad2等兔抗大鼠一抗及抗兔二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影照相，留取條帶圖。最后對(duì)所得的目的條帶進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠體重、血糖和血脂情況比較 與正常組比較，MS組和MS+H2S組體重、血壓、三酰甘油及總膽固醇水平明顯上升(P<0.05)，而以上所測(cè)的指標(biāo)在MS組和MS+H2S組之間則無(wú)明顯差別(P>0.05)。見表1。

表1 各組體重、血壓、三酰甘油、總膽固醇及TGF-β1蛋白、Smad2蛋白、膠原纖維沉積

2.2各組心肌組織Masson染色對(duì)比分析 與正常組比較，MS組的心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，鏡下可見到較多藍(lán)染的纖維，而與MS組對(duì)比，MS+H2S組鏡下可見膠原沉積情況顯著改善(P<0.05)。H2S組與正常組大鼠心肌組織的膠原纖維沉積無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1。

深藍(lán)色條狀物即為被染色的膠原纖維，紅染的為肌纖維圖1 H2S對(duì)大鼠心肌纖維化沉積的影響(Masson染色，×400)

2.3各組心肌組織TGF-β1蛋白的表達(dá)情況 與正常組比較，MS組心肌組織中TGF-β1的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與MS組相比，H2S+MS組心肌組織中TGF-β1的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。而H2S組與正常組大鼠心肌組織TGF-β1的表達(dá)對(duì)比無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)。見表1、圖2。

2.4各組心肌組織中Smad2的表達(dá) 與正常組比較，MS組心肌組織中Smad2的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；而與MS組對(duì)比，H2S+MS組心肌組織中Smad2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。而H2S組與正常組心肌組織Smad2蛋白的表達(dá)水平對(duì)比無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組心肌組織中TGF-β1、Smad2蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

隨著久坐、高能量飲食等生活習(xí)慣的變化及肥胖人群的增多，MS目前已經(jīng)變成了一種日益嚴(yán)峻的全球性健康問(wèn)題，其主要以胰島素抵抗、中心型/腹型肥胖、血糖及血脂異常等多種物質(zhì)在體內(nèi)代謝紊亂為臨床表現(xiàn)，并可促進(jìn)多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展〔9，10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，MS可直接導(dǎo)致心肌損傷和負(fù)性心室重構(gòu)，增加心血管疾病發(fā)生率，最終可致使心臟舒張功能障礙，甚至是心力衰竭〔11〕。本研究通過(guò)高糖高脂飲食喂養(yǎng)的方式構(gòu)建MS模型成功后，Masson染色顯示MS組大鼠的心肌細(xì)胞排列無(wú)序，細(xì)胞間可見大量藍(lán)染的纖維，提示MS組大鼠的心肌存在明顯的纖維化。

有研究顯示，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬等參與了MS心肌纖維化的發(fā)生，但其中的具體調(diào)控機(jī)制尚不十分明確〔12，13〕。TGF-β是重要的致纖維化細(xì)胞因子，在成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)、增殖、遷移及轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮了重要的作用，往往在機(jī)體各臟器發(fā)生纖維化時(shí)不可或缺。目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中主要存在有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這三種形式，而在TGF-β信號(hào)通路中，Smads是一種關(guān)鍵的傳導(dǎo)分子，其作為最初被證實(shí)的TGF-β受體激酶底物，主要作用是將從TGF-β接收的信號(hào)直接由細(xì)胞膜傳入到細(xì)胞核內(nèi)。TGF-β被激活后可活化胞質(zhì)內(nèi)的Smads，從而進(jìn)入核內(nèi)并調(diào)控轉(zhuǎn)錄。已有諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad2通路參與了多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程〔14〕。在心肌梗死過(guò)程中，TGF-β1活化后可作用于Smad2/3，使其發(fā)生磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，可以誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞(MFB)向促纖維化的MFB表型分化，最終導(dǎo)致心肌纖維化〔15〕。本研究提示TGF-β1/Smad2通路可能參與了MS心肌纖維化發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控機(jī)制。

H2S是一種在一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后出現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，已有相關(guān)報(bào)道表示，在一定濃度下對(duì)心、腦、腎等機(jī)體重要器官具有一定的保護(hù)作用，而其發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制主要涉及促進(jìn)自噬、抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥、改善代謝等〔16，17〕。已發(fā)現(xiàn)H2S可以下調(diào)P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及TGF-β1改善糖尿病小鼠的心肌纖維化〔18〕。本研究結(jié)果提示，當(dāng)使用外源性H2S后，MS大鼠的心肌纖維化得到了非常明顯的改善，而TGF-β1/Smad2相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也顯著下調(diào)，表明H2S干預(yù)后可減輕MS大鼠的心肌纖維化，其可能與抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路有關(guān)。綜上所述，內(nèi)源性H2S可能通過(guò)TGF-β1/Smad2通路參與了MS心肌纖維化發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，而外源性H2S供體藥物可能在改善MS心肌纖維化具有重要的應(yīng)用前景，而其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。