左振魁 韓佳瑞 計樹靈 賀露露

(1河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)，河南 鄭州 450000；2河南中醫(yī)藥大學)

近年來，便秘發(fā)生率逐漸增加，已成為影響人們健康的常見疾病〔1〕。結腸的傳導功能出現(xiàn)異常，致使攝入的食物在腸道中大量貯存，或通過腸道的時間延長，從而引起慢傳輸型便秘〔2〕。臨床治療慢傳輸型便秘時，多選擇瀉藥，癥狀未緩解者再予以手術，但存在藥物不良反應、手術并發(fā)癥等問題，效果有待于進一步提高。補腎潤腸方為河南省中醫(yī)院治療慢傳輸型便秘的協(xié)定方，由經(jīng)典方劑簡化改進而來，補腎潤腸方對慢傳輸型便秘患者病情的改善效果顯著，但其機制仍不明確?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)及椎前神經(jīng)節(jié)共同對胃腸運動闡釋調控作用，腦部中樞系統(tǒng)、脊髓是接收信息及整合信息的重要器官，通過神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)及自主神經(jīng)系統(tǒng)對調控信息進行傳輸，使其進入腸神經(jīng)系統(tǒng)，并對胃腸效應細胞產生調控作用，促使胃腸道充分使用內部環(huán)境、外部環(huán)境的變化，從而促使其生理功能的實現(xiàn)〔3〕。此連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)的神經(jīng)-內分泌網(wǎng)絡即為腦-腸軸，于腸道功能的調控中，腦-腸軸的雙相信號傳導功能尤其關鍵〔4〕。本研究基于腦-腸軸探討補腎潤腸方對慢傳輸型便秘水通道蛋白(AQP)3、AQP9的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與材料 選取85只成年健康SPF級SD大鼠，均由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，18～20月齡，體重200～220 g，均在相同條件下進行飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度50%～65%，且在飼養(yǎng)期間保證12 h的光暗條件循環(huán)，本研究已獲得動物倫理委員會批準。補腎潤腸方劑：熟地黃、白術及山茱萸各20 g，肉蓯蓉、瓜蔞仁、懷牛膝、火麻仁、當歸、萊菔子、何首烏、杏仁及枳殼各15 g，為保證飲片的質量，由同仁堂有限公司藥師對研究用藥進行鑒定，且均證實為正品。伊托必利(山東信誼制藥，H37023049)，復方聚乙二醇電解質散〔舒泰神(北京)生物制藥，H20040034〕；蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，H8070)，二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，ZLI-9032)，由英國Abcam公司提供AQP3兔多克隆抗體；由SantaCruz公司提供AQP9兔多克隆抗體及目的基因一抗；由Epigentek集團公司提供山羊抗兔二抗；總RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司，16596-026)；β-actin鼠單克隆抗體(英國Abcam公司，ab8226)。

1.2儀器 BX50型光學顯微鏡(OLYMPUS)，902ULTS型-80℃冰箱(美國Thermo)，Thermo3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)，5804R型離心機(德國Eppendorf)，EG1160型包埋機(LEICA)，RM2245型切片機(LEICA)，由美國Bio-Rad公司提供CFX96型實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀；由北京六一儀器廠提供DYCZ-25D型電泳儀、DYCZ-40G型轉膜儀；由美谷分子儀器有限公司(上海)提供SpectraMaxiD5型多功能酶標儀；由日本Olympus公司提供FV1200型激光共聚焦顯微鏡；由美國Bio-Rad公司提供UniversalHoodⅢ型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)。

1.3分組和造模 對大鼠進行為期1 w的適應性飼養(yǎng)，將其隨機分為空白組(10只)及造模組(75只)，選擇復方地芬諾酯進行造模，使用15 mg/(kg·d)復方地芬諾酯進行灌胃，在灌胃1個月后建立慢傳輸型便秘模型〔5〕。大鼠在2 w內出現(xiàn)明顯便秘癥狀。與空白組相比，模型組體重明顯減輕，24 h糞便數(shù)量明顯減少，糞便含水量也減少，說明成功復制大鼠模型。剔除造模失敗大鼠，將造模成功的大鼠(50只)進行二次分組，分為模型組、伊托必利組和補腎潤腸方低、中、高劑量組各10只。

1.4給藥 補腎潤腸方劑 藥液制作方法：將藥材置于砂鍋內，加2 000 ml水浸泡30 min，煎煮60 min后取汁200 ml，再次加水、浸泡后煎煮，取汁200 ml，充分混勻2次取得的藥液400 ml，采用減壓濃縮法，將補腎潤腸方液湯濃縮為濃度為2.2 g/ml的藥液，計算出藥量為高劑量組33.2 g/(kg·d)、中劑量組16.6 g/(kg·d)、低劑量組8.8 g/(kg·d)。根據(jù)相關文獻記載進行伊托必利藥物劑量選擇〔6〕，根據(jù)人和動物體表面積折算方法對大鼠用藥劑量進行換算，確定各組大鼠用藥劑量，即伊托必利組按50 mg/kg劑量灌胃，補腎潤腸方低、中、高劑量組分別按相應劑量灌胃，空白組及模型組進行等體積生理鹽水灌胃，各組灌胃1次/d，持續(xù)干預1個月。

1.5標本制備方法 ①結腸組織。在完成干預后統(tǒng)一頸椎脫臼處死大鼠，處死前禁食24 h，將大鼠腹部切開，確定胃底位置，然后由幽門位置將腸管捋出并摘除，摘除范圍為幽門至直腸末端肛管上方，然后根據(jù)腸管位置不同分別截取近端及遠端結腸各3 cm，將結腸組織均分為3段，對結腸內污物采用生理鹽水進行清洗，然后再使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進一步清洗，隨機選取其中一節(jié)腸管使用濃度為10%的多聚甲醛進行固定處理，將剩余兩節(jié)腸管放置于冰箱中保存，溫度設置為-80℃。②腦組織。于大鼠枕骨大孔進刀，將顱骨切開后，去除頭頂骨，并將視神經(jīng)剪斷，取出腦組織，用人工腦脊液對表面血液進行沖洗，并以濾紙將殘留血液吸除。于冰盤上對大腦組織進行剝離，提取前額葉皮質、下丘腦、海馬及紋狀體，放入1.5 ml Eppendorf離心管中，存儲于-80℃冰箱內待檢。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化檢測AQP3、AQP9表達 ①HE染色：脫蠟。于4%多聚甲醛中置入1段結腸，予以固定24 h后，石蠟包埋切片，水化。于二甲苯中予以浸泡15 min，連續(xù)2次后，依次以梯度乙醇及純水浸泡，各5 min，連續(xù)2次。染色。以蘇木素進行初染，沖洗，伊紅復染，依次以梯度乙醇及純水浸泡，各2 min，再予以二甲苯透明處理2 min后，中性樹膠進行封片，于光鏡鏡頭下進行檢查。②免疫組化：取HE染色的組織塊，4 μm切片，切片按照順序電烤箱1 h，在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中浸泡10 min，然后依次放在梯度酒精5 min×2次，隨后用PBS(pH7.4)沖洗2 min×3次，浸入枸櫞酸鹽緩沖液內，20 min后PBS沖洗5 min×3次，在切片上滴加濃度為10%的正常山羊血清封閉液，進行15 min孵育，溫度設置為37℃。滴加一抗(按照1∶100稀釋)，孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加二抗(IgG)，PBS沖洗3次，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察染色程度，將其置入蘇木素溶液中，分化使用鹽酸乙醇，常規(guī)進行脫水、透明及封片等處理，然后在鏡下觀察，通過Motic3000顯微鏡觀察。

1.7Western印跡檢測AQP3、AQP9蛋白表達 對蛋白濃度進行調整，相同后添加緩沖液，加熱至100℃，維持沸騰狀態(tài)10 min，在制膠架上展開分離膠制作，將電泳緩沖液加入其中，條帶分離達到最佳狀態(tài)時即可停止電泳。對轉膜液進行4℃預冷處理，轉膜90 min后，將聚偏氟乙烯膜取出并做標記，以TBST洗膜10 min，連續(xù)3次。將封閉液加入至封閉盒內，震蕩60 min，于裝有AQP3、AQP9Ⅰ抗的孵育盒內添加聚偏氟乙烯膜，置于4℃環(huán)境中過夜。以TBST洗膜10 min，連續(xù)3次，稀釋Ⅱ抗，再以TBST洗膜10 min，連續(xù)3次。于暗室對包含蛋白質的聚偏氟乙烯膜進行曝光處理。

1.8高效液相-電化學檢測儀對大鼠腦區(qū)神經(jīng)遞質的含量 于0.5 ml預冷工作內標液中加入待測腦組織，在冰浴條件下以電動微量勻漿器展開快速勻漿，予以靜置10 min后，于4℃環(huán)境中予以14 000 r/min×15 min離心，取上清液后以Millipore 0.22 μm針頭式過濾器進行過濾。色譜條件為：①預柱：ESAHR-80，8.0 cm×4.6 cm；②流動相：10%乙腈、1.7 mmol/L1-辛烷磺酸鈉、pH=3、90 mmol/L磷酸二氫鈉、50 μmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L檸檬酸；③色譜柱：ESAMD-150(3.2 mm×150 mm)；④流速：0.66 ml/min；⑤柱溫：30℃；⑥進樣量：20 μl；⑦電勢：共4道，分別是150、500、200、350 mV。

1.9實時熒光定量PCR檢測結腸細胞AQP3、AQP9 mRNA表達 提取結腸中的mRNA采用Trizol法進行，嚴格參照說明書操作，用核酸蛋白儀對總mRNA提取后的純度進行檢測，純度在1.8～2.0時為合格，進行逆轉錄合成，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒操作要求進行，各種試劑添加均嚴格按照SYBRPremixExTaqTM試劑盒說明書進行，基因擴增在PCR儀中完成，反應條件設置為溫度95℃，反應時間為10 min，然后95℃，反應10 s，最后60℃，反應30 s，共進行40個循環(huán)，然后溫度95℃，反應15 s，溫度75℃，反應15 s，溫度設置為75℃，反應30 s。對PCR過程中各組樣本中的Ct值進行分析，mRNA相對表達水平采用2-△△Ct表示。光密度值采用酶標儀進行測定，內參β-actin及AQP9、AQP3引物序列為：β-actin：上游：5′-GAAGATCAAGATCATTGCTC CT-3′,下游:5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′;AQP3:上游:5′-GTTCCGTGGCTCAAGTGGTGCTCAG-3′，下游:5′-GCAGGGTTCAAG TGGGCTCCAGACA-3′;AQP9:上游:5′-TCGGCAGT CGTGATGGCTCTCTATGA-3′，下游:5′-AGGCACCTGGCGTGGATATGAATGGA-3′。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，方差齊則采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3及AQP9光密度表達 AQP3呈現(xiàn)帶狀條形規(guī)律分布，主要分布位置為大鼠近端結腸組織黏膜頂部吸收細胞的質膜頂部(腔面)上，陽性染色為棕黃色；AQP9同樣呈現(xiàn)條帶狀規(guī)律分布，主要分布在大鼠遠端結腸組織黏膜的杯狀細胞上，染色為棕黃色。與空白組相比，模型組AQP3、AQP9光密度值明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，伊托必利組、補腎潤腸方低、中、高劑量組AQP3、AQP9光密度值明顯降低(P<0.05)，與伊托必利組相比，補腎潤腸方低、高劑量組AQP3、AQP9光密度值明顯升高(P<0.05)，而補腎潤腸方中劑量AQP3、AQP9光密度值無明顯差異(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組AQP3、AQP9光密度表達(HE染色，×400)

表1 各組AQP3及AQP9光密度比較

2.2各組結腸組織AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達 與空白組相比，模型組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，伊托必利組、補腎潤腸方高劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，補腎潤腸方低、中劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與伊托必利組相比，補腎潤腸方低、中劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，補腎潤腸方高劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表2。

1～6：空白組，模型組，伊托必利組，補腎潤腸方低劑量組，補腎潤腸方中劑量組，補腎潤腸方高劑量組圖2 各組結腸組織AQP3、AQP9蛋白表達

表2 各組結腸組織中AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達

2.3各組腦區(qū)神經(jīng)遞質含量比較 與空白組相比，模型組皮質、下丘腦、海馬甲腎上腺素(NE)水平明顯升高，多巴胺(DA)及5-羥色胺(HT)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較,伊托必利組及補腎潤腸方各組皮質、下丘腦、海馬中NE水平明顯降低，DA及5-HT水平明顯升高(P<0.05)；與伊托必利組相比，補腎潤腸方各組皮質、下丘腦、海馬中NE水平降低，DA及5-HT水平升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，補腎潤腸方各組各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 各組腦區(qū)神經(jīng)遞質含量比較

3 討 論

慢傳輸型便秘是老年人常見病，中醫(yī)學將慢傳輸型便秘歸于“便悶”范疇，《素問·靈蘭秘典論篇》有“大腸者，傳導之官，變化出焉”的觀點，強調大腸的功能是對小腸、脾胃消化吸收后的糟粕進行傳導，大腸傳導功能正常，糞便能夠正常排出；大腸傳導功能異常，糞便則無法排出，引起便秘〔7〕。中醫(yī)治療慢傳輸型便秘的重點在于“通下”，補腎潤腸為主要措施之一，方中山茱萸及熟地黃滋腎陰，而肉蓯蓉暖腰潤腸，具補腎陽之效，三者共作君藥，可雙補陰陽；白術補氣健脾，可促大腸運化；何首烏及當歸均補血潤腸；枳殼及萊菔子能寬腸下氣助通便；牛膝補腎壯腰；杏仁降肺氣及滋腸燥；瓜蔞仁及火麻仁均潤腸通便〔8〕。諸藥合用，共奏潤腸通便及補腎益精之效。

本研究提示補腎潤腸方組的干預效果雖未達到健康水平，但各項指標均與伊托必利組相似，表明補腎潤腸方能使老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3、AQP9表達降低。AQP3為胃腸神經(jīng)遞質，在消化系統(tǒng)中大量分布，于大腸、胃部及小腸中均有表達，其含量出現(xiàn)異常是引起便秘及腹瀉的重要因素之一〔9〕。到目前為止，在腸道內已發(fā)現(xiàn)存在十多種AQPs表達，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9最為常見，目前已有研究指出，AQP3在結腸組織中存在高表達時，腸道內水分明顯減少，而出現(xiàn)AQP3低表達時，腸道內水分增加〔10〕。研究指出，在進行細胞染色時發(fā)現(xiàn)，其染色部位主要集中在杯狀細胞的基底側，在便秘患者中，存在AQP9低表達情況，分析其水平下降與患者便秘癥狀存在相關性〔11〕。結腸中AQP3及AQP9含量升高與大鼠糞便含水量呈負相關，即大鼠結腸內AQP3及AQP9含量升高，致使腸道平滑肌出現(xiàn)痙攣，腸道的吸水能力增強，影響腸道蠕動頻率，導致便秘出現(xiàn)。補腎潤腸方具有潤腸通便及補腎益精的功效，通過對老年慢傳輸型便秘大鼠進行干預，使其腸道的平滑肌張力得到有效控制，降低結腸中糞便的推進阻力，改善便秘程度，促進大鼠順利排便，使AQP3、AQP9表達降低〔12〕。

研究發(fā)現(xiàn)，內分泌異常、腦-腸軸紊亂、心理應激、腸道動力異常及免疫功能異常等均可能引起便秘，且各種發(fā)病機制相互作用，于腦-腸軸內，胃腸道效應細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)間產生神經(jīng)傳遞作用的物質即腦腸肽，而慢傳輸型便秘出現(xiàn)后，患者血液、腸黏膜中腦腸肽含量發(fā)生改變，呈現(xiàn)出失衡狀態(tài)〔13〕。胃腸道功能處于應激狀態(tài)時，NE與5-HT均會活化，并于機體活動調節(jié)中處于對立統(tǒng)一關系，其中NE能使中樞系統(tǒng)興奮，而5-HT能對中樞系統(tǒng)產生抑制作用。DA為NE前體，同時又是獨立神經(jīng)遞質，于腦-腸軸內可對胃腸功能產生調節(jié)作用〔14〕。本研究結果提示，補腎潤腸方可對老年慢傳輸型便秘大鼠中樞神經(jīng)遞質及胃腸激素的腦-腸軸產生調控作用，原因可能是通過發(fā)揮補腎潤腸方潤腸通便及補腎益精的功效，在改善患者腸道功能的同時，促使患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復，并且調節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質，從而促使神經(jīng)遞質改善。

綜上，補腎潤腸方可降低老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3、AQP9表達，并對中樞神經(jīng)遞質及胃腸激素的腦-腸軸產生調控作用。但由于生物體內在機制十分復雜，且實驗設計還存在一定缺陷，可能使本研究結果受到影響。對此，后續(xù)需加大研究樣本量，并且展開重復實驗。