李成龍 周華 黃娟 王文 肖蓉

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川 成都 610072)

造血干細(xì)胞(HSCs)是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，主要存在于臍血、胎盤、骨髓等組織中，具有自我更新和分化成各類成熟血細(xì)胞的能力〔1〕。HSCs移植已應(yīng)用到臨床造血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等多種疾病的治療，具有良好的應(yīng)用效果，但其仍存在來(lái)源有限、移植失敗等問(wèn)題〔2〕。研究HSCs維持穩(wěn)態(tài)、自我更新和定向分化的機(jī)制，對(duì)于臨床治療具有重要意義。高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種由免疫細(xì)胞分泌的DNA結(jié)合蛋白，可以通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞等釋放細(xì)胞因子〔3〕。張力蛋白同源物(PTEN)是一個(gè)抑癌基因，可以維持造血干細(xì)胞的靜息狀態(tài)，在維持造血發(fā)育中具有重要作用〔4〕。已有研究顯示〔5，6〕，HMGB1可以上調(diào)PTEN的表達(dá)，還可以促進(jìn)HSCs的增殖、分化和遷移，但其對(duì)HSCs的作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)，探索了HMGB1/PTEN通路對(duì)HSCs功能的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 CO2培養(yǎng)箱、全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)FASCAN Becton Dickison；CD34+細(xì)胞選擇試劑盒、MiniMACS磁珠分選系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotech公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑HMGB1 siRNA、非特異性的siRNA(NS siRNA)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnologieso；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；促紅細(xì)胞生成素(EPO)和促血小板生成素(TPO)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；β-actin鼠單克隆抗體、兔抗人單克隆抗體、HMGB1、PTEN、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、p21和細(xì)胞周期素依賴激酶(CDK)4均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。骨髓血樣本由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科采集，來(lái)源于身體健康的骨髓供體，年齡<60歲，無(wú)遺傳病史，經(jīng)供體及其家屬知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 采用免疫磁珠分選法分離人HSCs細(xì)胞〔7〕，無(wú)菌采集骨髓血20 ml，采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，離心(2 000 r/min，20 min)，吸取中間白膜層，重懸，加入5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，離心(1 200 r/min，5 min)，重懸，采用磁珠細(xì)胞分選免疫磁性吸附柱分離裝置，常見(jiàn)標(biāo)志物CD34+分選HSCs。

1.3細(xì)胞處理與分組 將HSCs細(xì)胞分為對(duì)照組和HMGB1 siRNA組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSCs細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，HMGB1 siRNA組轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染NS siRNA。采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，取各組HSCs細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR，HMGB1引物序列：上游5′-GCTCCCATAGAGTACACCGGG-3′，下游5′-CCTCATCCTTGAACTTCGT-CGC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。體系：95℃預(yù)熱5 min，95℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算HMGB1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)HMGB1、PTEN、TGF-β1、p21和CDK4蛋白的表達(dá) 收集各組HSCs，采用細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，取50 ng蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，采用TBST洗膜并加一抗，于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜加二抗，于室溫下孵育2 h。再用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯示，收集影像，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對(duì)比條帶強(qiáng)弱，選用β-actin作為內(nèi)參。

1.5CCK-8法檢測(cè)HSCs的增殖活性 取各組HSCs細(xì)胞100 μl以2×103個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于1、2、3、4 d進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，每孔分別加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A450)。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSCs細(xì)胞周期 收集兩組HSCs，加入1 ml 70%冷乙醇固定1 h，離心，加入0.5 mg/ml的RNase處理，37℃孵育1 h，一次加入10 μl碘化丙啶(PI，10 μg/ml)混合，避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞周期，ModFit LT分析并擬合計(jì)算各時(shí)期細(xì)胞百分比。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSCs細(xì)胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集各組HSCs，依次加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl PI染色液混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8HSCs細(xì)胞體外集落形成能力 收集各組HSCs 1×105個(gè)/ml，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次。采用甲基纖維素法檢測(cè)紅系祖細(xì)胞(CFU-E)，體系：30%小牛血清白蛋白，0.9 g/L甲基纖維素，0.1 μmol/L二巰基乙醇，3% L-谷氨酰胺，1 U/ml EPO；粒-巨噬系祖細(xì)胞(CFU-GM)體系：30%小牛血清白蛋白，0.9 g/L甲基纖維素，20 μg/L重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；巨核系祖細(xì)胞(CFU-MK)體系：40 ng/ml白細(xì)胞介素(IL)-3、IL-6、TPO，0.05 μmol/L二巰基乙醇；多向造血祖細(xì)胞(CFU-Mix)體系：40 ng/ml IL-3、IL-6、TPO，20 μg/L重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，1 U/ml EPO，0.05 μmol/L二巰基乙醇，3% L-谷氨酰胺，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下記錄集落數(shù)，CFU-E：集落為8～50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，于第5～7天計(jì)數(shù)；CFU-GM：集落為≥40個(gè)的細(xì)胞團(tuán)，于第7天計(jì)數(shù)；CFU-MK：集落為≥3個(gè)巨噬細(xì)胞，于第18天計(jì)數(shù)；CFU-Mix：集落為≥50個(gè)的細(xì)胞團(tuán)(含紅系、粒系、巨噬系/巨核系)，于第14天計(jì)數(shù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HSCs細(xì)胞HMGB1轉(zhuǎn)染效率 與對(duì)照組(1.00±0.00)相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞HMGB1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(0.32±0.02；t=83.283，P<0.001)。

2.2HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞HMGB1、PTEN和CDK4的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，TGF-β1和p21的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)及增殖能力的影響

2.3HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖能力均明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞G0期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，G1期細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

2.6HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞集落形成能力的影響 與對(duì)照組相比，HMGB1 siRNA組HSCs細(xì)胞的CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix集落形成能力均明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞周期、凋亡、集落形成能力影響

圖2 HMGB1缺失對(duì)HSCs細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

HSCs具有自我更新和分化能力，可以分化為造血祖細(xì)胞并最終生成各種血液細(xì)胞〔8〕。維持HSCs數(shù)量和功能的穩(wěn)定對(duì)于預(yù)防造血系統(tǒng)損傷和血液系統(tǒng)疾病具有重要意義〔9〕。HMGB1是一種炎癥相關(guān)的損傷分子，近年來(lái)研究顯示〔10〕，HMGB1可以調(diào)節(jié)某些干細(xì)胞功能，誘導(dǎo)其增殖分化。PTEN基因編碼產(chǎn)物為脂質(zhì)磷酸酶，PTEN基因缺失可以激活TGF-β信號(hào)通路，抑制HSCs的自我更新，引起HSCs衰竭，甚至轉(zhuǎn)化為白血病細(xì)胞〔11〕。已有研究顯示〔12〕，阻斷HMGB1可以抑制PTEN的活性，上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，參與HSCs調(diào)控。本研究結(jié)果提示HMGB1可以上調(diào)PTEN的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)。TGF-β1屬于TGF-β家族，可以激活下游的Smad，參與調(diào)控HSCs的功能。已有研究顯示〔13〕，PTEN可以抑制TGF-β1信號(hào)通路，在HSCs的調(diào)控中具有重要作用，提示HMGB1缺失可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路參與調(diào)控HSCs的自我更新和定向分化能力。

本研究中，HMGB1缺失可以明顯抑制HSCs細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞周期阻滯，提示HMGB1在HSCs細(xì)胞增殖的調(diào)控中具有重要作用。臨床研究顯示〔14〕，TGF-β1對(duì)HSCs具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，TGF-β1/Smad信號(hào)通路的過(guò)度激活可以抑制HSCs的活性，從而抑制HSCs的增殖，影響其分化能力。Vaidya等〔15〕的研究顯示，TGF-β可以下調(diào)CDK4的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯于G1/S檢查點(diǎn)，使細(xì)胞停滯于G1期，從而抑制HSCs細(xì)胞增殖，提示HMGB1缺失可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。本研究結(jié)果提示HMGB1缺失可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路，上調(diào)p21的表達(dá)，下調(diào)CDK4的表達(dá)。CDK4是細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白協(xié)同作用，共同調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程〔16〕。p21是細(xì)胞周期抑制因子，可以抑制CDKs復(fù)合物活性，抑制HSCs的細(xì)胞周期〔17〕。Wang等〔18〕的研究顯示，阻斷HSCs的TGF-β1信號(hào)通路后，p21的水平顯著下調(diào)，CDK4的表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖能力明顯升高，提示HMGB1缺失可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路，作用于下游細(xì)胞周期相關(guān)靶蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。本研究中，HMGB1缺失可誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞凋亡。Blank等〔19〕的研究顯示，TGF-β1信號(hào)通路可以參與調(diào)控HSCs的增殖、分化和凋亡，抑制HSCs的自我更新能力，提示HMGB1可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路，抑制HSCs的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制HSCs的自我更新能力。

本研究中，HMGB1缺失均可以明顯抑制HSCs的CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix。CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix分別反映了HSCs分化為紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞和多向造血祖細(xì)胞的能力〔20〕，提示HMGB1缺失可以抑制HSCs定向分化為成熟血液細(xì)胞的能力。Li等〔21〕的研究顯示，PTEN可以激活HSCs，提高HSCs的定向分化能力，與本研究結(jié)果基本相符，提示HMGB1缺失可能通過(guò)下調(diào)PTEN的表達(dá)，抑制HSCs的定向分化能力。Hinge等〔22〕的研究顯示，TGF-β1信號(hào)通路的激活可以使HSCs維持在靜息狀態(tài)，抑制其進(jìn)入細(xì)胞周期，抑制CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix集落的數(shù)目和體積，與本研究結(jié)果基本相符，提示HMGB1缺失可以抑制HSCs定向分化為成熟血液細(xì)胞的能力。

綜上，HMGB1缺失可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活TGF-β1信號(hào)通路，抑制HSCs的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制HSCs的自我更新和定向分化能力。但本研究?jī)H探索了體外HMGB1/PTEN信號(hào)通路對(duì)HSCs功能的影響，HMGB1/PTEN信號(hào)通路對(duì)體內(nèi)HSCs功能的影響有待于下一步研究探索。