王煜 趙嵐 闞伯紅 史慧妍 賈玉潔

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1針灸科，天津 300193；2針灸研究所)

我國(guó)腦部疾病的發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重的腦部疾病常表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞明顯凋亡〔1〕，日常生活中以認(rèn)知障礙、語(yǔ)言功能障礙等為主要特征〔2〕。減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡并且通過(guò)一定醫(yī)療手段促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)對(duì)治療腦部疾病有一定效果。常規(guī)藥物治療副作用較大，不宜長(zhǎng)期進(jìn)行〔3，4〕。針刺主要通過(guò)抑制神經(jīng)過(guò)度興奮反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等來(lái)改善患者情況。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植治療腦部疾病獲得了一定進(jìn)展，但對(duì)于針刺是否能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化還需進(jìn)一步研究。NSCs存在于胚胎細(xì)胞及哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是一種具有多種分化潛能的細(xì)胞。NSCs具有多種分化功能如自我更新的能力，產(chǎn)生多種細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等〔5〕，調(diào)控并參與神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能并對(duì)大腦結(jié)構(gòu)起決定性作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等生命過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，在胚胎干細(xì)胞上起主要調(diào)節(jié)作用，過(guò)多會(huì)引起NSCs增殖受到抑制，氨基酸殘基磷酸化促進(jìn)其激活，轉(zhuǎn)化為磷酸化(p)-STAT3，調(diào)節(jié)NSCs增殖〔6，7〕，本研究探討針刺對(duì)NSCs活性及STAT3蛋白水平的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只小鼠購(gòu)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其中SAMP8小鼠40只(針刺組和SAMP8組各20只)；SAMR1小鼠20只(SAMR1組)，鼠齡在8 w左右，飼養(yǎng)室溫為24℃左右，體重在25～30 g，自由活動(dòng)包括進(jìn)食與飲水(純凈水)，在無(wú)壓環(huán)境下讓60只小鼠自由生活適應(yīng)1 w新環(huán)境。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與器材 STAT3抗體(武漢菲恩生物有限公司)、溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)一抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類有限公司)、鈣結(jié)合蛋白(S100β)抗體(杭州聯(lián)科生物有限公司)、性別決定相關(guān)基因簇(SOX)-2抗體(艾美捷科技有限公司)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(上海玉博有限公司)。

1.3方法

1.3.1針刺干預(yù) 針刺組選取百會(huì)、血海、腎俞、膈俞、百會(huì)向后平刺3～5 mm，血海、腎俞直刺2～3 mm，膈俞以80°角斜向上刺2～3 mm。進(jìn)針后，血海、膈俞施捻轉(zhuǎn)瀉法，施針?lè)?80～360°，頻率50～60次/min；腎俞、百會(huì)施捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，施針?lè)?0～90°，頻率120～150次/min，運(yùn)針1 min，留針10 min。SAMP8組及SAMR1組小鼠給予同等程度的捉抓刺激，時(shí)間相同。每日1次，連續(xù)48 d。

1.3.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(學(xué)習(xí)能力檢測(cè)) 對(duì)所有小鼠連續(xù)干預(yù)48 d后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行為期4 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)能力，將小鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)并爬向平臺(tái)的時(shí)間和路程，若小鼠超過(guò)120 s還未能找到平臺(tái)，用木棍指引其游上平臺(tái)并停留20 s，進(jìn)行下一次訓(xùn)練，記錄分別記錄水迷宮實(shí)驗(yàn)1～4 d小鼠逃避潛伏期時(shí)間。

1.3.3腦組織取材 免疫熒光染色：處死前1 d腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，8 h/次，共3次。戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉，40 g/L熒光示蹤灌注固定液(CAS)灌注固定大腦，整腦取出后在40 g/L CAS中浸泡過(guò)夜。取整塊腦組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和連續(xù)冠狀切片。

1.3.4蘇木素-伊紅(HE)染色 腹腔注射麻醉斷頭處死大鼠，將取出的雙側(cè)海馬利用甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水，石蠟包埋后切4 μm片，封閉處理應(yīng)用山羊血清進(jìn)行，蘇木素和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察SAMP1組、SAMP8組、針刺組海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)改變情況。

1.3.5免疫熒光檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 取腦組織切片置于2 mol/L HCl中進(jìn)行DNA變性處理，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，滴加BrdU一抗和S100β一抗，室溫孵育60 min。沖洗后，加入帶熒光二抗室溫孵育 50 min。BrdU/小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Iba-1)雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法與以上步驟相同。SOX-2和GFAP染色采用自由漂洗熒光雙染色法檢測(cè)，冰凍切片與SOX-2抗體和GFAP在Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)中4℃過(guò)夜孵育，體積分?jǐn)?shù)3%驢血清封閉。組織切片清洗后，帶熒光二抗孵育2 h。采用共聚焦顯微鏡計(jì)數(shù)至少50個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞并確定細(xì)胞表型。

1.3.6TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將腦組織放入4%的CAS中固定、保存。石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水；用蛋白酶K孵育。滴加50 μl的TUNEL反應(yīng)混合溶液、孵育，加入50 μl轉(zhuǎn)化劑-植物過(guò)氧化物酶(POD)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析。加入二胺基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，在光鏡下分析圖像。

1.3.7Western印跡檢測(cè)STAT3及其磷酸化蛋白表達(dá) 取大鼠海馬組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，充分研磨，離心取上清液，蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移至磷酸纖維素(NC)膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入STAT3、p-STAT3和β-actin抗體孵育過(guò)夜，洗片，辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗片，顯色，暗室曝光，顯影，定影，按照說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 在不同染色指標(biāo)下，3組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均有顯著差異(P<0.05)，BrdU/S100β雙標(biāo)染色下，針刺組相比于SAMP8組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，但與SAMR1組對(duì)比均明顯減少(均P<0.05)；BrdU/Iba-1雙標(biāo)染色下，針刺組相比于SAMP8組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，但與SAMR1組對(duì)比明顯減少(均P<0.05)；SOX-2/GFAP雙標(biāo)染色下，針刺組相比于SAMP8組及SAMR1組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均明顯增加(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 3組不同染色指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×400)

表1 3組海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較

2.23組HE染色結(jié)果 SAMP1組海馬組織中神經(jīng)元完整，有少量壞死，排列整齊；SAMP8組海馬組織中出現(xiàn)大量的壞死神經(jīng)元、細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)染色較淺且出現(xiàn)固縮、組織排列紊亂，針刺組與SAMP8組相比有明顯改善，見圖2。

圖2 3組海馬組織HE染色(×400)

2.33組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較 SAMR1組海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率〔(6.45±0.72)%〕最低，SAMP8組〔(21.78±3.17)%〕和針刺組神經(jīng)元凋亡〔(13.56±1.43)%〕明顯高于SAMR1組(均P<0.05);與針刺組相比，SAMP8組神經(jīng)元凋亡升高明顯(P<0.05)，見圖3。

箭頭所指深棕色為凋亡神經(jīng)元細(xì)胞圖3 3組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡(DAB，×400)

2.43組逃避潛伏期比較 3組逃避潛伏期均隨著天數(shù)的增多而逐漸縮短，時(shí)間比較存在顯著差異(P<0.001)；不同時(shí)間點(diǎn)中，與SAMR1組比較，SAMP8組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與SAMP8組比較，針刺組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，組間與時(shí)間存在交互作用，見表2。

表2 3組小鼠逃避潛伏期比較

2.53組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較 SAMR1組海馬組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)量與SAMP8組、針刺組相比明顯降低(P<0.05)；與SAMP8組相比，針刺組STAT3、p-STAT3表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，見表1、圖4。

圖4 3組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

針刺作為具有悠遠(yuǎn)發(fā)展歷史的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)多種疾病的治愈起到了橋梁作用，配合其他藥物輔助療法，對(duì)腦損傷及一些心腦血管疾病的防御與治療有一定的積極意義。對(duì)不同的穴位行針刺處理并持續(xù)一段時(shí)間后能提高機(jī)體免疫力與代謝功能，對(duì)血管起修復(fù)作用的同時(shí)增加血流量，對(duì)于心腦血管的預(yù)防有積極作用。NSCs作為具有多種分化潛能的細(xì)胞〔8〕，其主要分布在大腦的皮層、和海馬等重要部位，且處于靜止?fàn)顟B(tài)。神經(jīng)元凋亡的發(fā)生可能與NSCs損傷有關(guān)，研究證實(shí)其損傷會(huì)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生〔9〕。本文以BrdU標(biāo)記檢測(cè)NSCs再生現(xiàn)象，結(jié)果表明針刺對(duì)SAMP8小鼠NSCs的分化、再生有一定積極意義。BrdU可參與到細(xì)胞的合成，是一種胸腺嘧啶類似物。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示分裂細(xì)胞，因此其陽(yáng)性數(shù)目大小對(duì)定義NSC增生程度具有一定的間接作用〔10〕。高蕙蘭等〔11〕通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予腦缺血再灌注大鼠2 w電針刺激干預(yù)后，與模型組相比，電針刺激后腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能有所改善，BrdU和雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高，說(shuō)明針刺對(duì)于腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，且作用機(jī)制與促進(jìn)BrdU表達(dá)使得神經(jīng)細(xì)胞再生有直接關(guān)系。目前針刺對(duì)于腦部疾病應(yīng)用較為廣泛，針刺對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，可增加大腦血流量，促進(jìn)腦組織修復(fù)，同時(shí)針刺可以減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制其損傷〔12〕。

針刺通過(guò)對(duì)穴位進(jìn)行刺激，可改善老年癡呆小鼠的記憶，且相對(duì)安全。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)近年來(lái)已逐漸成熟，因其簡(jiǎn)單易操作被作為檢測(cè)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能的重要實(shí)驗(yàn)方法之一〔13〕。高音來(lái)等〔14〕通過(guò)對(duì)血管性癡呆大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)心通督法針刺組大鼠相對(duì)于模型組及西藥組大鼠，其學(xué)習(xí)能力更優(yōu)，其作用機(jī)制與促進(jìn)海馬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BFGF)表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)性。有研究認(rèn)為電針能夠改善腦部疾病，通過(guò)對(duì)損傷腦組織細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，提高缺氧腦組織細(xì)胞分泌，增加腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而提高學(xué)習(xí)及認(rèn)知能力〔15〕。這與本文研究結(jié)果相似。

STAT3在腦部疾病患者中往往呈現(xiàn)高表達(dá)。STAT3蛋白調(diào)節(jié)著不同的細(xì)胞生命過(guò)程，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用，控制細(xì)胞的分化及凋亡等，STAT3蛋白在胚胎干細(xì)胞更新，氨基酸殘基的磷酸化促進(jìn)其激活，磷酸化后進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化為p-STAT3蛋白后通過(guò)下游的靶基因調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖〔16〕。研究表明，STATs蛋白家族廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，其作用機(jī)制與調(diào)控Fas、Fas-L、Bcl-2信號(hào)通路有關(guān)〔17〕。在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡逐漸增加，原因可能為酪氨酸蛋白激酶(JAK)-STAT3通路的激活能夠抑制抗凋亡因子的作用，從而使患者情況惡化。p-JAK2、STAT3蛋白在腦損傷部位表達(dá)較正常部位有所增強(qiáng)，并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡，而JAK/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，影響其增殖分化的同時(shí)影響神經(jīng)功能恢復(fù)〔18,19〕?？赚摰取?0〕研究發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)穴能夠提高大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，針刺大鼠可抑制其腦組織STAT3及其磷酸化的表達(dá)水平，從而對(duì)腦出血大鼠腦組織起到保護(hù)作用。STAT3與神經(jīng)元凋亡及NSCs的增殖有一定的關(guān)系，并且針刺能夠?qū)TAT3產(chǎn)生一定的抑制作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究〔21〕。

綜上所述，針刺能夠促進(jìn)SAMP8小鼠神經(jīng)元的增殖分化并抑制STAT3蛋白表達(dá)，對(duì)于改善SAMP8小鼠行為能力有一定的積極意義。