李佳欣 紀(jì)海茹 任立群 齊潔敏 (承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 承德 067000)

胃癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，多數(shù)患者進(jìn)展到中晚期才被確診，易復(fù)發(fā)，且預(yù)后不佳〔1〕，給人類生命健康帶來嚴(yán)重威脅。雖然目前胃癌的治療方法有一定進(jìn)步，但是治療效果一般，5年生存率依舊不高〔2〕。有研究顯示炎癥〔3〕和細(xì)胞凋亡異?！?〕與腫瘤發(fā)生及演變有著緊密的聯(lián)系。白細(xì)胞介素(IL)-32作為促炎細(xì)胞因子，在促進(jìn)腫瘤生成，調(diào)控細(xì)胞凋亡或增殖中扮演著極其重要的角色〔5〕。凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，被認(rèn)為是凋亡體的核心。目前關(guān)于IL-32、Apaf-1在胃癌組織中的研究少有報(bào)道，同步檢測(cè)兩者相關(guān)性文章還未見報(bào)道。本研究探討IL-32、Apaf-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2018年10月至2019年11月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及秦皇島市中心醫(yī)院60例胃癌患者手術(shù)切除后的組織標(biāo)本，所有患者經(jīng)臨床病理診斷確診為胃腺癌，手術(shù)前均未進(jìn)行放、化療治療。另選取同期60例正常胃黏膜上皮組織標(biāo)本(距離胃癌組織邊緣>5 cm)作為本次實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)照。

1.2染色方法

1.2.1主要試劑 購買IL-32兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Affinity公司)、Apaf-1兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Cell Signal公司)、免疫組化(SP)試劑盒(北京中杉金橋公司)等。

1.2.2SP法 甲醛溶液固定好組織標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋，4 μm厚切片，根據(jù)免疫組化試劑盒說明書步驟進(jìn)行規(guī)范操作，陽性對(duì)照組為已知的陽性胃腺癌切片，空白對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)低倍及高倍光學(xué)顯微鏡觀察，IL-32、Apaf-1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)明確著色的黃色或棕黃色顆粒即可判定為陽性反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同高倍顯微鏡(×400)下的視野用于后續(xù)觀察，按照染色強(qiáng)度高低及陽性細(xì)胞數(shù)占比兩項(xiàng)結(jié)果綜合判定陽性表達(dá)。根據(jù)染色強(qiáng)度判定陽性評(píng)分：無染色計(jì)為0分；染色強(qiáng)度呈淡黃色計(jì)為1 分；棕黃色計(jì)為2 分；棕褐色計(jì)為3 分，按照陽性染色細(xì)胞數(shù)所占比例判定陽性評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)百分率<5% 計(jì)為0分；≥5%且<25%計(jì)為1分；≥25%且<50%計(jì)為2分；≥50%計(jì)為3分。將以上兩項(xiàng)判定的得分相乘即可得到最終結(jié)果：乘積0～1分判定為陰性(-)，>1分判定為陽性(+)〔6〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1IL-32、Apaf-1蛋白在胃癌及正常胃黏膜上皮組織中表達(dá)情況 胃癌組織與正常胃黏膜上皮組織中IL-32、Apaf-1蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔70.0%(42/60) vs 38.3%(23/60)、31.7%(19/60) vs 75.0%(45/60)；χ2=12.117、22.634，均P<0.001〕。見圖1。

圖1 IL-32、Apaf-1蛋白表達(dá)情況(SP法，×400)

2.2IL-32、Apaf-1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 IL-32、Apaf-1表達(dá)與患者的性別差異、年齡大小均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，與胃癌分化程度的高低、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期情況、浸潤(rùn)深度的不同均明顯相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 IL-32、Apaf-1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3IL-32、Apaf-1在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性 42例IL-32陽性患者中Apaf-1陽性9例，IL-32、Apaf-1蛋白在胃癌組織中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.336，P=0.009)。

3 討 論

中國(guó)癌癥發(fā)病率增速最快，其中胃癌發(fā)病率、死亡率分別居于前三位〔7〕，高于全球平均水平〔8〕。

腫瘤微環(huán)境中存在大量炎癥細(xì)胞因子，IL-32作為一種促炎細(xì)胞因子，不僅與炎癥性疾病息息相關(guān)，對(duì)惡性腫瘤的生長(zhǎng)有重要的調(diào)節(jié)作用〔9〕。楊正斌等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中，IL-32的表達(dá)上調(diào)，并且隨組織分化程度降低而升高；Zhai等〔11〕發(fā)現(xiàn)IL-32蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高，與腫瘤大小和Dukes分期密切相關(guān)，認(rèn)為IL-32可作為結(jié)腸癌患者新的預(yù)后生物標(biāo)記物；在乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-32蛋白在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抵抗凋亡〔12〕。本研究結(jié)果提示IL-32蛋白的過表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并且對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移也有一定的促進(jìn)作用，這與Tsai等〔13〕研究結(jié)果一致。

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。Apaf-1作為一種促凋亡因子，可通過線粒體途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其在人類的各種正常組織中廣泛表達(dá)，而在腫瘤組織中卻呈現(xiàn)異常表達(dá)的狀態(tài)。Abdelrahman等〔14〕在漿液性卵巢癌病例中觀察到Apaf-1蛋白表達(dá)下調(diào)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度密切相關(guān)；李益波等〔15〕檢測(cè)到Apaf-1蛋白及mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中為低表達(dá)；Ahn等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)Apaf-1蛋白結(jié)直腸癌患者的組織中存在表達(dá)缺失的現(xiàn)象，猜測(cè)這種缺失與結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。陳吉等〔17〕采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)到Apaf-1蛋白在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，本實(shí)驗(yàn)提示Apaf-1蛋白的低表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上，胃癌的發(fā)生可能是由于IL-32表達(dá)升高，Apaf-1表達(dá)降低協(xié)同作用所致，可通過下一步細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究二者的致癌機(jī)制，有助于對(duì)胃癌的預(yù)后判斷和靶向治療提供新思路。