蔣天華，周慶豐，嚴(yán)專強(qiáng)，周展

1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527439

aMPV可在多種原代和傳代細(xì)胞內(nèi)增殖，PATNAYAK等［14］比較了aMPV疫苗毒株在BHK-21、Vero、BGM-70、MA-104、McCoy、DF-1、QT-35和 火 雞 原 代CEF中的增殖情況，發(fā)現(xiàn)這8種細(xì)胞均能很好地適應(yīng)aMPV的培養(yǎng)。本研究采用分批培養(yǎng)的方法探討懸浮BHK-21細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)及aMPV增殖的工藝，優(yōu)化生物反應(yīng)器內(nèi)BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)及aMPV增殖的工藝參數(shù)，并對(duì)制備的疫苗進(jìn)行動(dòng)物安全性和攻毒保護(hù)試驗(yàn)，以期為aMPV減毒活疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及病毒 BHK-21懸浮細(xì)胞由上海倍諳基生物科技有限公司提供；aMPV S-01（傳代致弱毒株）和BL強(qiáng)毒株由溫氏食品集團(tuán)股份有限公司保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3日齡雛番鴨購自廣東省開平市某公司，檢測(cè)無APV母源抗體；40周齡產(chǎn)蛋番鴨購自溫氏集團(tuán)股份有限公司種鴨場(chǎng)，產(chǎn)蛋正常，無異常癥狀。

1.3主要試劑及儀器 BHK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基Tac-S101S購自上海倍諳基生物科技有限公司，使用超純水配制成細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)無菌0.22μm濾膜過濾除菌，置4℃?zhèn)溆?；BC-7L、BC-20L和BC-200L生物反應(yīng)器購自廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀JSY-SC-031購自深圳博大博聚科技有限公司。

1.4生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BH K-21細(xì)胞及aM PV工藝的優(yōu)化

1.4.1初始細(xì)胞接種密度的優(yōu)化 常規(guī)復(fù)蘇BHK-21懸浮細(xì)胞，接種搖瓶?jī)?nèi)，置振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)5.0×106cells/mL時(shí)，按不同初始細(xì)胞密度5.0×105、8.0×105和1.0×106cells/mL接種BC-7L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)條件均為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)3 d，期間每12 h取樣，觀察不同初始細(xì)胞接種量下細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.4.2病毒接種劑量的優(yōu)化 BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)3.0×106cells/mL后，向生物反應(yīng)器內(nèi)添加培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106cells/mL，分別按MOI=0.01、0.05和0.10接種aMPV S-01弱毒株，培養(yǎng)條件均為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察不同病毒接種劑量下細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.4.3病毒接種條件的優(yōu)化 通過L9（33）正交試驗(yàn)確定S-01弱毒株最適接種條件，試驗(yàn)因素水平見表1。BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)3.0×106cells/mL后，向生物反應(yīng)器內(nèi)添加培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為對(duì)應(yīng)的密度條件，使用二氧化碳和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH為對(duì)應(yīng)條件，按表1中不同MOI接種病毒。1 h后培養(yǎng)條件設(shè)為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并留樣檢測(cè)病毒效價(jià)。以病毒最高效價(jià)為指標(biāo)，效價(jià)越高，表示病毒接種條件越優(yōu)。

白鷲習(xí)慣了天空，在這種戰(zhàn)斗下，它們是處于劣勢(shì)的。但它們?nèi)匀徊豢想x去，只護(hù)在女子的上空，不時(shí)俯沖下來，與周圍的土狼死拼。

表1 病毒接種條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal test design of condition for virus inoculation

1.4.4最佳病毒接種條件的驗(yàn)證及最佳收毒時(shí)間的優(yōu)化 在BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)采用1.4.3項(xiàng)得出的最佳病毒接種條件進(jìn)行病毒接種驗(yàn)證試驗(yàn)，病毒接種后培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并留樣檢測(cè)病毒效價(jià)。

1.5200 L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng) BHK-21細(xì)胞經(jīng)搖瓶和BC-7L生物反應(yīng)器放大后，按最佳初始細(xì)胞接種密度逐級(jí)導(dǎo)入BC-20L和BC-200L生物反應(yīng)器繼續(xù)放大培養(yǎng)，按1.4.4項(xiàng)經(jīng)BC-7L生物反應(yīng)器驗(yàn)證過的最佳病毒接種條件進(jìn)行200 L生物反應(yīng)器規(guī)模驗(yàn)證，接種病毒后培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并留樣檢測(cè)病毒效價(jià)。

1.6aM PV S-01株弱毒疫苗的制備 將病毒培養(yǎng)液離心，收取上清即為弱毒疫苗，根據(jù)免疫劑量用生理鹽水稀釋備用。

1.7aM PV致弱株毒力返強(qiáng)試驗(yàn) 將10只體型相近、性別相同的3日齡雛番鴨通過點(diǎn)眼滴鼻接種S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份。接種96 h后隨機(jī)撲殺5只，觀察病理變化，留存氣管和肺臟等組織樣本供下一次傳代使用，撲殺后留存5只，繼續(xù)隔離飼養(yǎng)觀察。使用上一代組織病料研磨液再通過點(diǎn)眼滴鼻接種10只3日齡雛番鴨，0.2 mL/羽份，如此共進(jìn)行5次回歸傳代。取第1和第5代試驗(yàn)鴨氣管和肺臟組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，同時(shí)對(duì)組織樣品進(jìn)行病毒再分離，分離的病毒樣品送華大基因測(cè)序公司測(cè)序，序列使用DNASTAR和MEGA 7.0軟件進(jìn)行對(duì)比和分析［15］。

1.8動(dòng)物安全性試驗(yàn) 將20只體型相近的40周齡產(chǎn)蛋番鴨隨機(jī)分成2組，10只/組，A組通過點(diǎn)眼滴鼻、肌注和泄殖腔導(dǎo)入同時(shí)接種aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B組為空白對(duì)照組。接種后3周內(nèi)每天觀察臨床癥狀，并記錄產(chǎn)蛋情況，評(píng)價(jià)疫苗的安全性。

1.9動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將30只體型相近、性別相同的1日齡雛番鴨隨機(jī)分為3組，10只/組，A組于1和15 d點(diǎn)眼滴鼻接種aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B組同時(shí)點(diǎn)眼滴鼻接種相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)基溶液；C組為空白對(duì)照組。接種后28 d各組分別經(jīng)肌肉注射aMPV BL強(qiáng)毒株，觀察21 d，記錄疫苗保護(hù)情況。

1.10細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒效價(jià)測(cè)定 采用JSY-SC-031全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞密度；測(cè)定按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部（2015版）附錄27方法檢測(cè)接毒后樣品效價(jià)（TCID50）。

2 結(jié)果

2.1生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BH K-21細(xì)胞及aM PV工藝的優(yōu)化

2.1.1初始細(xì)胞接種密度的優(yōu)化 3種不同初始細(xì)胞密度接種BC-7L生物反應(yīng)器，初始接種密度為5.0×105cells/mL時(shí)，細(xì)胞延滯期較長(zhǎng)，48 h后開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期；初始接種密度為8.0×105cells/mL時(shí)，細(xì)胞延滯期較短，12 h后開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期；初始接種密度為1.0×106cells/mL時(shí)，細(xì)胞快速進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，72 h后密度可達(dá)1.6×107cells/mL。見圖1。細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)接種或傳代時(shí)，保持密度高于1.0×106cells/mL有利于細(xì)胞快速增殖。

圖1 不同初始接種密度BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較Fig.1 Growth curves of BHK-21 cells at different initial densities

2.1.2病毒接種劑量的優(yōu)化 3種劑量接種病毒后，細(xì)胞均能繼續(xù)生長(zhǎng)，MOI=0.01時(shí)，細(xì)胞于接種病毒后60 h開始停止生長(zhǎng)，密度達(dá)最高，為8.2×106cells/mL；MOI=0.05時(shí)，細(xì)胞于接種病毒后48 h開始生長(zhǎng)減緩，其后細(xì)胞量小幅增長(zhǎng)，84 h密度達(dá)最高，為6.1×106cells/mL；MOI=0.10時(shí)，細(xì)胞于接種病毒后48 h開始停止生長(zhǎng)，最高密度為5.6×106cells/mL。見圖2。細(xì)胞接種病毒后24 h內(nèi)正常生長(zhǎng)，24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，接種病毒劑量越大，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制越明顯。

圖2 接種不同劑量病毒后BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較Fig.2 Growth curves of BHK-21 cells inoculated with aMPV at different MOIs

2.1.3病毒接種條件的優(yōu)化 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。極差分析表明，影響因素大小依次為病毒接種劑量＞病毒接種pH＞細(xì)胞密度，最佳病毒接種條件組合為：細(xì)胞密度3.0×106cells/mL，病毒接種劑量MOI=0.10，病毒接種pH 6.8。

表2 病毒接種條件正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of condition for virus inoculation

2.1.4最佳病毒接種條件的驗(yàn)證及最佳收毒時(shí)間的優(yōu)化 BC-7L生物反應(yīng)器規(guī)模最佳病毒接種條件驗(yàn)證結(jié)果見圖3，72 h病毒效價(jià)最高，峰值為108.67TCID50/mL，符合預(yù)期。

圖3 7 L和200 L生物反應(yīng)器接種病毒后病毒滴度比較Fig.3 Titers of viruses cultured in 7 L and 200 L bioreactors

2.2200 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)規(guī)模驗(yàn)證 BC-200L生物反應(yīng)器規(guī)模驗(yàn)證結(jié)果見圖3，84 h病毒效價(jià)最高，峰值為108.50TCID50/mL，與BC-7L生物反應(yīng)器規(guī)模結(jié)果基本一致，符合預(yù)期。2.3aM PV致弱株毒力的穩(wěn)定性 5代毒力返強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，各代次病毒攻毒后，鴨只均未出現(xiàn)咳嗽、氣管啰音等臨床癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)雛鴨鼻腔清亮無黏液，內(nèi)臟器官正常，氣管和肺臟切片未見明顯病理變化，見圖4。序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，第1代與第5代毒株核苷酸序列同源性為99.9%以上。核苷酸序列僅發(fā)生了11個(gè)突變，其中主要抗原基因F發(fā)生2個(gè)突變，抗原基因G發(fā)生1個(gè)突變，均為無義突變。見圖5。

圖4 顯微鏡觀察雛鴨攻毒后肺臟（A）及氣管（B）的病理變化Fig.4 Pathological change of lung（A）and trachea（B）of ducklings after virus challenge

圖5 F基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)情況Fig.5 Comparison of amino acid sequences deduced from nucleotide sequence of F gene

2.4動(dòng)物安全性 2組動(dòng)物觀察期內(nèi)食欲和精神狀況良好，產(chǎn)蛋正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，表明S-01株弱毒疫苗具有良好的安全性。

2.5動(dòng)物攻毒保護(hù)效果 攻毒后7 d，B和C組動(dòng)物出現(xiàn)典型的aMPV感染癥狀，保護(hù)率為0%；A組在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，保護(hù)率為100%。

3 討論

aMPV自20世紀(jì)70年代末在南非被發(fā)現(xiàn)以來，已在世界大部分地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，對(duì)家禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［16-17］。疫苗接種是預(yù)防aMPV感染的有效方法，國(guó)外已有aMPV滅活疫苗和減毒活疫苗上市，但我國(guó)至今仍無上市疫苗。

機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器已應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)在7 L機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器中對(duì)aMPV懸浮培養(yǎng)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大，初始接種密度低于1.0×106cells/mL時(shí)，細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一段較長(zhǎng)的延滯期；初始接種密度為1.0×106cells/mL時(shí)，延滯期不明顯，細(xì)胞快速進(jìn)入指數(shù)期生長(zhǎng)，72 h后密度可達(dá)1.6×107cells/mL。細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)接種或傳代時(shí)，保持密度高于1.0×106cells/mL對(duì)于維持細(xì)胞活性狀態(tài)，提高生產(chǎn)效率具有重要意義。細(xì)胞被病毒感染后，由于病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，細(xì)胞正常分裂生長(zhǎng)會(huì)受到抑制并逐漸死亡。aMPV按不同劑量感染BHK-21細(xì)胞后，細(xì)胞仍能維持一段時(shí)間的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸受到抑制，接種病毒劑量越大，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用越明顯。比較各組最高細(xì)胞密度，為保證細(xì)胞活性和營(yíng)養(yǎng)供給，接種病毒時(shí)細(xì)胞密度不宜超過3.0×106cells/mL。贠炳嶺［18］比較了低pH對(duì)不同亞型aMPV中F蛋白融合活性的影響，發(fā)現(xiàn)低pH環(huán)境能促進(jìn)aMPV/CF蛋白活性，細(xì)胞數(shù)量和病毒接種劑量是影響病毒增殖后效價(jià)的重要因素。本研究通過L9（33）正交試驗(yàn)篩選出最佳病毒接種條件組合為：細(xì)胞密度3.0×106cells/mL，病毒接種劑量MOI=0.10、病毒接種pH 6.8，經(jīng)驗(yàn)證，在該條件下，病毒效價(jià)最高可達(dá)108.67TCID50/mL。反應(yīng)器規(guī)模放大后，攪拌帶來的剪切力會(huì)相應(yīng)提高，隨著體積增加，均一性變差，部分區(qū)域參數(shù)超出控制范圍，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)變緩、活率降低和生產(chǎn)效率下降等問題，嚴(yán)重者甚至?xí)构に嚪糯笫。?9］。本研究將7 L生物反應(yīng)器上的運(yùn)行和操作參數(shù)逐級(jí)復(fù)制放大至新反應(yīng)器系統(tǒng)上，以病毒效價(jià)為指標(biāo)，考察在200 L生物反應(yīng)器上運(yùn)行情況，病毒效價(jià)最高可達(dá)108.50TCID50/mL，與7 L生物反應(yīng)器上結(jié)果基本一致。毒力返強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果表明，S-01株弱毒疫苗對(duì)敏感雛番鴨無致病性，毒力遺傳性穩(wěn)定。動(dòng)物安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗安全性良好，不會(huì)引起產(chǎn)蛋番鴨染病和嚴(yán)重不良反應(yīng)。動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗可有效免疫雛番鴨。

綜上所述，本研究對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)aMPV增殖和放大工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為aMPV減毒活疫苗的研制及進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。