施金榮，周志軍，程小玲，楊爽，李茜，羅敏，石艷紅，李策生，李陶敬

1.武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北武漢 430207；

2.國藥集團武漢血液制品有限公司科研開發(fā)部，湖北武漢 430207；

3.北京天壇生物制品股份有限公司研發(fā)中心，北京 100024

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的急性感染性肺炎。COVID-19疫情暴發(fā)后，我國迅速研制了SARS-CoV-2的核酸檢測試劑及其抗體快速檢測試劑（膠體金測試卡），均已批準用于大規(guī)模檢測［1-2］。核酸檢測法研發(fā)速度快、靈敏度高，在前期疫情防控工作中發(fā)揮了重要作用［3-4］。與抗體膠體金測試卡比較，抗原膠體金測試卡可更早識別SARS-CoV-2感染，更利于疫情防控［5-6］?？乖z體金測試卡的臨床檢測靈敏度與核酸技術相當，應對突變更可靠，堿基點突變不會馬上導致氨基酸突變，個別氨基酸突變不會導致抗原改變；SARS-CoV-2抗原穩(wěn)定性遠高于RNA，不易降解，不會受假陰性假陽性困擾；檢測簡單易行，無需任何專業(yè)設備設施，可用于家庭自檢。抗原膠體金測試卡與核酸檢測聯(lián)合使用，優(yōu)勢互補，可大幅提高檢出率［7-10］。

目前，全球COVID-19疫情仍較嚴峻，SARSCoV-2抗原膠體金測試卡缺口較大，多個廠家處于試劑研發(fā)和注冊申報過程中。由于陽性樣品不易獲取，多數廠家在研發(fā)過程中無法通過大量樣品檢測來評估膠體金測試卡質量。武漢生物制品研究所有限責任公司（簡稱武漢公司）研發(fā)的SARS-CoV-2滅活疫苗具有良好的安全性和有效性，該疫苗原液為2次滅活2步純化的完整病毒顆粒，未添加氫氧化鋁佐劑；滅活的SARS-CoV-2培養(yǎng)液為病毒收獲液經1次滅活的上清，包含完整病毒、病毒碎片和細胞碎片，更接近自然感染條件下病毒存在狀態(tài)。本實驗選用經2次滅活的SARS-CoV-2疫苗原液、經1次滅活的SARS-CoV-2培養(yǎng)液及重組SARS-CoV-2 N蛋白建立SARS-CoV-2抗原檢測用陽性樣品盤，用于膠體金抗原測試卡的抗原檢測靈敏度評價。同時以部分呼吸道病毒和細菌疫苗原液作為陰性對照，建立SARS-CoV-2抗原檢測用陰性樣品盤。陰陽性樣品盤結合用于SARS-CoV-2抗原測試卡的研發(fā)和質量評估?，F(xiàn)將評估結果報道如下。

1 材料與方法

1.1S A R S-C o V-2抗原膠體金測試卡 分別由湖北工業(yè)大學免疫學與生物醫(yī)藥研究團隊［共8批22個亞批：20200810（重組S蛋白單抗）、2020082911～2020-082914（重組S蛋白單抗）、2020082921～2020082927（重組S蛋白單抗）、2020092301和2020092302（重組N和S蛋白單抗）、2021011201～2021011203（天然N蛋白單抗）、20200201和20200202（天然N蛋白單抗）、202100310（天然N蛋白單抗）、N8067210430和N8067210725（天然N蛋白單抗）］、國為生物科技泰州有限公司［批號：202007308a（重組S蛋白單抗）］、杭州隆基生物技術有限公司［科研批號：S20-2007081～202007086（重組S和N蛋白單抗各3批），生產批號：S2021（重組N蛋白單抗），已獲歐盟CE認證］、武漢匯海醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司［批號：2020-0714（重組N蛋白單抗），已獲歐盟CE認證］、廣州和信健康科技有限公司［批號：20201205（重組N蛋白單抗），已獲歐盟CE認證］、深圳市惠安生物科技有限公司［批號：210101（重組N蛋白單抗），已獲歐盟CE認證］、長沙三諾生物傳感股份有限公司［批號：20210201（重組N蛋白單抗），已獲歐盟CE認證］提供，分別編號為廠家A～G。

1.2S A R S-C o V-2核酸檢測相關試劑 RNA提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit（批號：166012741）購自德國QIAGEN GmbH公司；SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（批號：nCOV20210302）購自上海捷諾生物科技有限公司。

1.3S A R S-C o V-2抗原檢測用樣品盤的建立

1.3.1陰性樣本盤 包括流感病毒疫苗H1、H3、BY、BV 4種病毒血清型原液（血凝素含量分別為685、246、207、353μg/mL）、脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated poliovirus，IPV）的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種病毒血清型原液（抗原含量分別為3 120、436、2 223 DU/mL）、腸道病毒71型（enterovirus，EV71）滅活疫苗（Vero細胞）原液（抗原含量為18 047 U/mL）、乙腦減毒活疫苗原液（病毒滴度為6.4 lgCCID50/mL）、白喉疫苗原液（蛋白氮含量為0.060%）、百日咳疫苗原液（抗原含量為130.1μg PN/mL）、破傷風疫苗原液（蛋白氮含量為0.042%）共12個非SARS-CoV-2滅活疫苗原液（均由武漢公司質保部提供）及黏蛋白（購自上海源葉生物科技有限公司，用1.4 mL注射用水溶解26 mg黏蛋白，獲得飽和溶液）。

1.3.2陽性樣本盤 包括重組SARS-CoV-2 N蛋白（批號：618-092320-B01，規(guī)格1 mg，10倍稀釋至1 pg/mL）、1批滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1（病毒滴度為7.2 lgCCID50/mL）及2批SARS-CoV-2滅活疫苗原液（B1和B2批，抗原含量分別為3 333和3 659 WU/mL；B1批對應滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液滴度為6.9 lgCCID50/mL，B2批對應滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液為S1）。重組SARS-CoV-2 N蛋白購自武漢普健生物科技有限公司，其他樣品均由武漢公司質保部提供。

1.4膠體金測試卡檢測及結果判定 抗原膠體金測試卡檢測為常規(guī)雙抗體夾心法，反應時間為15~20 min［11］。C線和T線均有顯色條帶，則判定為陽性；若C線有顯色條帶，T線無顯色條帶，則判定為陰性；若C線、T線均無顯色條帶，或僅有T線顯色，則表明試紙已失效，結果無效。

1.5核酸檢測及結果判定 核酸檢測方法參考文獻［12］。TEXAS RED通道為開放閱讀編碼框（ORF1ab），F(xiàn)AM通道為核殼蛋白（N）基因，兩者Ct＜37時判為陽性，無Ct或≥37時判為陰性；內部質控Cy5的Ct＜35時判為陽性，無Ct或≥35時判為陰性；同一份樣本的ORF1ab和N同時判為陽性，則該樣品判為陽性，若僅有1個通道為陽性，則需復試，復試仍僅有1個通道為陽性，則判為陽性。

1.6陽性樣品盤在S A R S-C o V-2抗原膠體金測試卡研發(fā)中的應用

1.6.1對4個廠家早期研發(fā)的SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡的陽性評估 取廠家A（批號：20200810，編號9）、B（批號：202007308a，編號7）、C（批號：S202007081～202007086，編號1~6）、D（批號：20200714，編號8）共9批SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡，對SARS-CoV-2滅活疫苗原液B1批進行檢測。廠家A需將樣品進行20倍稀釋，廠家B和D均進行10倍稀釋，廠家C進行2倍稀釋，按相應說明書要求進行操作。

1.6.2廠家A SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡研發(fā)的全程檢測 將SARS-CoV-2滅活疫苗原液B1用廠家A提供的裂解液進行1∶10稀釋，充分裂解病毒后，依次稀釋至1∶102~1∶104，采用廠家A的6批19個亞批（2020082911～2020082914、2020082921～2020082927、2020092301、2020092302、2021011201～2021011203、20210201～20200202、20210310）的膠體金測試卡進行檢測。觀察C線和T線的顯色情況，以能觀察到陽性結果的最高稀釋度作為該測試卡的最低檢測限，即靈敏度。

1.7S A R S-C o V-2抗原檢測用樣品盤在膠體金測試卡質量評估中的應用

1.7.1陰性樣品盤對SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡特異性的檢測 將SARS-CoV-2抗原檢測用陰性樣品盤用廠家A、C、E、F、G提供的裂解液進行10倍稀釋，采用相應廠家的膠體金測試卡（廠家A：N806-7210430和N8067210725，廠家C：S2021，廠家E：20200714，廠家F：210101，廠家G：20210201）進行檢測，并以相應裂解液作為陰性對照。

1.7.2陽性樣品盤對SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡靈敏度的檢測

1.7.2.1SARS-CoV-2滅活疫苗原液B2 將SARSCoV-2滅活疫苗原液B2用廠家A、C、E、F、G提供的裂解液進行1∶10稀釋，充分裂解病毒，再依次稀釋為1∶102~1∶106，用相應廠家的膠體金測試卡（批號同1.7.1項）進行檢測；以出現(xiàn)陽性結果的最高10倍稀釋度為起點，再進行2倍系列稀釋或1~5倍稀釋，進行再次檢測，觀察C線和T線的顯色情況，以能觀察到陽性結果的最高稀釋度作為該測試卡的最低檢測限。

1.7.2.2滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1 按1.7.2.1項方法檢測廠家A、C、E、F、G的6批抗原膠體金測試卡（批號同1.7.1項）對滅活的SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1的靈敏度，充分裂解病毒后，滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1進行10倍系列稀釋的稀釋度為1∶102~1∶107。1.7.2.3重組SARS-CoV-2 N蛋白 按1.7.2.1項方法檢測廠家A、C、E、F、G的6批抗原膠體金測試卡（批號同1.7.1項）對重組SARS-CoV-2 N蛋白的靈敏度，充分裂解病毒后，重組SARS-CoV-2 N蛋白的濃度為1~10 pg/mL，不再進行稀釋。

1.8核酸檢測試劑對滅活的S A R S-C o V-2培養(yǎng)物S1靈敏度的評價 將滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)物S1用生理鹽水進行10倍系列稀釋，稀釋度為1∶10~1∶1010。用RNA提取試劑提取RNA，通過核酸檢測試劑盒進行擴增檢測，以能觀察到陽性結果的最高稀釋度作為核酸檢測試劑的靈敏度，并將該結果與廠家A的N8067210430批膠體金測試卡檢測結果進行比較。

2 結果

2.1陽性樣品盤在S A R S-C o V-2抗原膠體金測試卡研發(fā)中的應用

2.1.1對4個廠家早期研發(fā)的SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡的陽性評估 廠家A的9號、廠家B的7號及廠家C的1、2、6號樣品均為陰性（重組S蛋白單抗），廠家C的3、4、5號為弱陽性（重組N蛋白單抗），表明N蛋白為檢測SARS-CoV-2抗原的主要位點，需使用針對N蛋白單抗進行后續(xù)優(yōu)化。廠家D的8號為強陽性（重組N蛋白單抗），T線陽性顏色較深，后期作為陽性對照測試卡用于廠家A的研發(fā)。見圖1。

圖1 4個廠家的膠體金測試卡檢測SARS-CoV-2滅活疫苗原液B1的結果Fig.1 Determination of bulk B1 of inactivated SARS-CoV-2 vaccine by colloidal gold test cassettes from four manufacturers

2.1.2廠家A SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡研發(fā)的全程檢測 廠家A早期針對SARS-CoV-2 S蛋白單抗制備的膠體金測試卡，即2020082911~20200-82914、2020082921~2020082927、2020092302批樣品均為陰性。后續(xù)改為針對SARS-CoV-2 N蛋白單抗制備膠體金測試卡，其中2020092301批為陽性，檢測限為1∶10；2021011201~2021011203和2021-0201~20200202批均為陽性，檢測限均為1∶103；20210310批檢測結果為陽性，檢測限為1∶2×103，進一步提高了靈敏度。

2.2S A R S-C o V-2抗原檢測用樣品盤在膠體金測試卡質量評估中的應用

2.2.1陰性樣品盤對SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡特異性的檢測 廠家A、C、E、F、G的SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡T線均未顯色，僅C線顯色，檢測結果均有效，為陰性（圖略）。

2.2.2陽性樣品盤對SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡靈敏度的檢測 N8067210430、N8067210725、S2021、20200714、F210101、20210201批膠體金測試卡對SARSCoV-2滅活疫苗原液B2的檢測限分別為1∶2×103（±）、1∶106（±）、1∶104（+）、1∶4×103（±）、1∶2×103（+）、1∶2×103（±），對滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1的檢測限分別為1∶5×105（+）、1∶2×107（±）、1∶106（+）、1∶2×105（±）、1∶105（+）、1∶104（+），其中±表示顯色線條較淺，需仔細辨認；+表示顯色線條較深，極易辨認。對重組SARS-CoV-2 N蛋白的檢測限分別為5 ng/mL及100、10、10、10、10 pg/mL。見圖2~圖4（僅呈現(xiàn)部分結果）。其中廠家A的N80672-10725批的靈敏度得到較大提高。

圖2 SARS-CoV-2滅活疫苗原液B2對5個廠家膠體金測試卡靈敏度的檢測結果Fig.2 Sensitivity test results of bulk B2 of inactivated SARS-CoV-2 by colloidal gold test cassettes from five manufacturers

圖4 重組SARS-CoV-2 N蛋白對5個廠家膠體金測試卡靈敏度的檢測結果Fig.4 Sensitivity test results of recombinant N protein of SARS-CoV-2 by colloidal gold test cassettes from five manufacturers

A：廠家A批號N8067210725（1～5：稀釋度分別為1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶2×107）；B：廠家A批號N8067210430（1～4：稀釋度分別為1∶2×105、1∶3×105、1∶4×105、1∶5×105）；C：廠家C（1～3：稀釋度分別為1∶105、1∶106、1∶107）；D：廠家F（1～5：稀釋度分別為1∶104、1∶105、1∶2×105、1∶4×105、1∶8×105）；E：廠家E（1～4：稀釋度分別為1∶104、1∶105、1∶2×105、1∶4×105）；F：廠家G（1～3：稀釋度分別為1∶104、1∶105、1∶2×105）。

2.3核酸檢測試劑對滅活S A R S-C o V-2培養(yǎng)物S1靈敏度的評價 滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)物S1稀釋至1∶107時，核酸檢測為弱陽性，稀釋至1∶108后為陰性，確定檢測限為1×107，見表1。通過與廠家A的N8067210430批的抗原膠體金檢測卡靈敏度（1∶5×108）比較表明，膠體金檢測卡的靈敏度可達到與核酸檢測試劑相當水平。

表1 不同濃度滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)物S1的核酸檢測情況Tab.1 Nucleic acid detection of inactivated SARS-CoV-2 culture S1 at various concentrations

3 討論

在SARS-CoV-2抗原膠體金測試卡研發(fā)早期，研發(fā)單位選用針對SARS-CoV-2 S蛋白的單抗進行研發(fā)，其中廠家A針對真核細胞重組表達的S蛋白不同位點單抗進行了多個組合及大量篩選，對重組S蛋白的檢測靈敏度達20 pg/mL，但用其檢測SARS-CoV-2滅活疫苗原液，結果卻為陰性。因此，廠家A改為針對重組N蛋白單抗進行研發(fā)，用其檢測SARS-CoV-2滅活疫苗原液結果為陽性，經篩選單抗、鑒定試紙配對、調整試紙寬度和裂解液等方面的調整，檢測靈敏度提高至1∶106。廠家C科研批（編號1~6）6組抗原測試卡涵蓋N和S蛋白不同單抗的組合，通過對SARS-CoV-2滅活疫苗原液的檢測，確定應以N蛋白為研發(fā)目標，靈敏度達1∶104。分析上述結果的原因是病毒的N蛋白表達量比S蛋白高約10倍，病毒破裂后釋放的N蛋白數量遠高于S蛋白，因此多個廠家均選擇N蛋白作為研發(fā)目標。

為比較重組SARS-CoV-2 N蛋白與真病毒N蛋白的差異，本實驗檢測了5家膠體金測試卡對重組N蛋白的靈敏度，檢測結果與病毒培養(yǎng)液的結果無對應性，該結果與相關文獻報道一致［13-14］，可能是由于重組蛋白與真病毒N蛋白的構象存在較大差異導致的。廠家A制備的膠體金測試卡對重組N蛋白檢測靈敏度僅為100 pg/mL，對滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1的靈敏度高達1∶2×107；廠家G對重組N蛋白的靈敏度較高（10 pg/mL），對滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1的靈敏度較低（1∶104）；廠家C對重組N蛋白（滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液10 pg/mL）、B2（1∶104）和S1（1∶106）的靈敏度均最高。差異原因可能為廠家A選用的重組N蛋白單抗是針對游離的真病毒N蛋白構象，廠家G選用的是針對重組N蛋白特異構象，廠家C選用的是針對N蛋白保守區(qū)的單抗。因此，廠家若以重組N蛋白作為產品研發(fā)的檢測標的，雖檢測靈敏度較高，但對針病毒培養(yǎng)物的檢測結果不佳，會產生誤導，因此僅可作為企業(yè)質控品，不能代替真病毒作為研發(fā)檢測標的。SARS-CoV-2滅活疫苗原液需經2次滅活和2次層析純化，以去除游離蛋白顆粒，留下的主要是完整的病毒顆粒。經1次滅活的SARS-CoV-2培養(yǎng)液最接近人體感染狀態(tài)，檢測結果可信度較高。采用5個廠家膠體金測試卡檢測滅活SARS-CoV-2培養(yǎng)液S1，結果表明，各廠家的膠體金測試卡靈敏度差異較大，僅有2家的靈敏度較高，廠家A最高，廠家C次之，其他廠家的靈敏度有待提升。5個廠家的膠體金測試卡對陰性樣品盤的檢測結果均為陰性，表明其對常見呼吸道病毒和細菌未發(fā)生交叉反應，但并不能完全代表呼吸道和消化道的真實環(huán)境，在轉化為唾液檢測時，部分廠家出現(xiàn)假陽性問題，其原因可能是部分廠家為了提高測試卡的靈敏度而忽略了穩(wěn)定性，需要通過尋找更好的單抗組合或大顆粒膠體金標記以解決該問題［15-17］。

另外，本實驗采用核酸檢測試劑盒對滅活SARSCoV-2培養(yǎng)液S1進行了檢測，并將該結果與廠家A的N8067210430批膠體金測試卡檢測結果進行了比較，結果顯示，兩者的靈敏度相當，表明本實驗建立的SARS-CoV-2抗原檢測用樣本盤可用于SARSCoV-2抗原膠體金測試卡的質量評價，為該測試卡的研發(fā)提供了技術支持。膠體金測試卡與核酸檢測聯(lián)合應用將大幅提高檢出率，提高對COVID-19防控效率。